一种山苍子提取液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及植物组织提取液和培养领域，更具体地，涉及一种山苍子提取液及其制备方法和应用。

背景技术：

山苍子(litseacubeba)是我国南方特有的工业原料和香料树种，其果实提炼的精油中柠檬醛含量极高，被广泛应用于医药、食品、化妆品等领域。建立山苍子的组培快繁体系，不仅能促进山苍子产业的发展，也可为山苍子的基础研究奠定基础。目前，山苍子的组织培养多以带芽茎段作为组培外植体材料，通过丛生芽的诱导进行离体快繁，但现有的方法存在丛生芽诱导率不高、增值系数较低的缺点，这严重制约了山苍子离体快繁的效率。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种山苍子提取液，将该山苍子提取液应用于山苍子的组织培养中，可显著提高山苍子丛生芽的诱导率和增值系数，从而提高山苍子离体快繁的效率，促进山苍子产业的发展。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种山苍子提取液，所述山苍子提取液的原料包括以下组分：山苍子、水和添加剂，所述添加剂为维生素c和/或聚乙烯吡咯烷酮，所述山苍子与所述添加剂的质量比为4-8：0.5-2.5。

本发明的目的之二在于提供一种所述山苍子提取液的制备方法，包括以下步骤：

1)取上述质量份的山苍子研磨成粉，得山苍子粉末；

2)将山苍子粉末与上述质量份的添加剂和部分水混合得混合液，经保温、离心分离后，取上清液，置于容器中，以水定容至刻度，即得。

优选的，步骤1)中山苍子为主干基部不定芽萌发出的幼嫩徒长枝，步骤1)中山苍子在液氮中研磨成粉。

优选的，步骤2)中，保温的具体步骤为将混合液置于40℃水浴锅中保温3-4小时。

优选的，步骤2)中，离心转速为8000-10000rpm/min，时间为3-5分钟。

本发明的目的还在于提供一种所述的山苍子提取液在山苍子组织培养中的应用。

优选的，所述组织培养包括以下步骤：以当年生的山苍子春稍带芽茎段为外植体；经预处理、消毒后，接种至腋芽生长培养基上进行培养，获取腋芽；将腋芽转移至丛生芽诱导培养基上进行培养，获取丛生芽，所述丛生芽诱导培养基内包括所述山苍子提取液；将丛生芽逐个分离后接种至生长培养基上培养，即可。

优选的，具体在应用过程中，山苍子组织培养包括以下步骤：

1)外植体的预处理：于每年4-5月初采集山苍子春稍带芽茎段，将采集的带芽茎段用洗洁精或洗衣粉洗涤后再置于流水下冲洗8-10小时，随后置于4-6℃的低温中预处理8-12小时；

2)外植体的消毒：在无菌操作台内，将低温预处理后的带芽茎段置于75％的乙醇中消毒10-15秒后，用无菌水冲洗4-5次，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5-7分钟，随后同样用无菌水冲洗4-5次，冲洗完毕后，将无菌的带芽茎段置于无菌水中备用；

3)腋芽的萌动与生长：将消毒后的带芽茎段接种至腋芽生长培养基上进行培养，所述腋芽生长培养基为ms+6-ba(1.7-2.2mg/l)+iba(0.5-0.7mg/l)+蔗糖(25-30g/l)+琼脂(8-10g/l)；培养温度为24-28℃，光周期为12小时光照12小时黑暗；

4)丛生芽的诱导：带芽茎段培养7-10天后，截取萌发的带2-3mm新生幼嫩茎段的腋芽，转移至丛生芽诱导培养基上进行培养13-15天；所述丛生芽诱导培养基为1/2ms+6-ba(1.7-2.2mg/l)+naa(0.1-0.3mg/l)+所述山苍子提取液(6-10ml/l)+蔗糖(25-30g/l)+琼脂(8-10g/l)；

5)将丛生芽逐个分离后接种至生长培养基上培养1周后，芽长势良好，可用于后续培养；所述生长培养基为ms+6-ba(1.7-2.2mg/l)+iba(0.5-0.7mg/l)+蔗糖(25-30g/l)+琼脂(8-10g/l)。

优选的，在步骤5)中，所述后续培养包括后续的生根培养或继续分化丛生芽培养等。

本发明的有益效果为：

本发明提供的山苍子提取液，将其应用于山苍子的组织培养中，可显著提高山苍子丛生芽的诱导率和增值系数，从而提高了山苍子离体快繁的效率；另外，本发明提供的山苍子提取液制备方法，其工艺简单、流程安全，能够较大程度的避免山苍子中的有效成分损失，有利于规模化和工厂化生产，从而促进山苍子产业的发展。

附图说明

图1是本发明实施例5中带芽茎段在腋芽生长培养基上培养7-10天后萌发生长的山苍子腋芽；

图2中a为实施例9中在丛生芽诱导培养基上培养13-15天后从腋芽基部分化出的丛生芽，b为实施例5中在丛生芽诱导培养基上培养13-15天后从腋芽基部分化出的丛生芽；

图3是本发明实施例5中分离后在丛生芽生长培养基上的丛生芽。

具体实施方式

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

实施例1山苍子提取液的制备

取山苍子主干基部不定芽萌发出的3cm长的幼嫩徒长枝4g，液氮研磨成粉后收集于50ml离心管内，加入25ml蒸馏水和0.5g维生素c，置于40℃水浴锅中保温3小时，随后8000rpm/min离心3分钟，吸取上清液定容至50ml，制得山苍子提取液a，置于4℃冰箱中备用。

实施例2山苍子提取液的制备

取山苍子主干基部不定芽萌发出的5cm长的幼嫩徒长枝8g，液氮研磨成粉后收集于50ml离心管内，加入30ml蒸馏水和1g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，置于40℃水浴锅中保温4小时，随后10000rpm/min离心5分钟，吸取上清液定容至50ml，制得山苍子提取液b，置于4℃冰箱中备用。

实施例3山苍子提取液的制备

取山苍子主干基部不定芽萌发出的4cm长的幼嫩徒长枝6g，液氮研磨成粉后收集于50ml离心管内，加入27ml蒸馏水、1g维生素c和1.5g聚乙烯吡咯烷酮(pvp)，置于40℃水浴锅中保温4小时，随后10000rpm/min离心4分钟，吸取上清液定容至50ml，制得山苍子提取液c，置于4℃冰箱中备用。

实施例4山苍子提取液的制备

取山苍子的顶芽4g，液氮研磨成粉后收集于50ml离心管内，加入25ml蒸馏水和0.5g维生素c，置于40℃水浴锅中保温3小时，随后8000rpm/min离心3分钟，吸取上清液定容至50ml，制得山苍子提取液d，置于4℃冰箱中备用。

实施例5山苍子提取液在山苍子组织培养中的应用

具体在应用过程中，包括以下步骤：

(1)外植体的预处理：2019年4月初于湖南省汨罗市神鼎山采集野生山苍子春稍带芽茎段，将采集的带芽茎段用洗洁精或洗衣粉洗涤后在流水下冲洗8小时，随后置于4℃的低温中预处理8小时；

(2)外植体的消毒：在无菌操作台内，将低温预处理后的带芽茎段置于75％的乙醇中消毒10秒后，用无菌水冲洗4次，再置于0.1％的升汞溶液中消毒5分钟，随后同样用无菌水冲洗4次，冲洗完毕后，将无菌的带芽茎段置于无菌水中备用；

(3)腋芽的萌动与生长：将消毒后的带芽茎段接种至腋芽生长培养基(ms+1.7mg/l6-baλ+0.5mg/liba+蔗糖25g/l+琼脂8g/l)上进行培养(培养温度24℃，光周期为12小时光照12小时黑暗)；培养2-3天后，腋芽开始萌动生长；

(4)丛生芽的诱导：带芽茎段培养7-10天后，如图1所示，截取萌发的带2-3mm新生幼嫩茎段的腋芽，转移至丛生芽诱导培养基(1/2ms+1.7mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+6ml/l山苍子提取液a+蔗糖25g/l+琼脂8g/l)上进行培养；培养13-15天后，从腋芽基部分化出较多丛生芽，如图2b所示；

(5)将丛生芽逐个分离后接种至丛生芽生长培养基(ms+1.7mg/l6-ba+0.5mg/liba+蔗糖25g/l+琼脂8g/l)上培养1周后，芽长势良好，如图3所示，可用于后续培养。

本实施例中，山苍子丛生芽的诱导率达到了96.29％，增值系数达到了14.36。

实施例6山苍子提取液在山苍子组织培养中的应用

具体在应用过程中，包括以下步骤：

(1)外植体的预处理：2019年4月初于湖南省长沙市桃花岭公园内采集野生山苍子春稍带芽茎段，将采集的带芽茎段用洗洁精或洗衣粉洗涤后在流水下冲洗10小时，随后置于6℃的低温中预处理12小时；

(2)外植体的消毒：在无菌操作台内，将低温预处理后的带芽茎段置于75％的乙醇中消毒15秒后，用无菌水冲洗5次，再置于0.1％的升汞溶液中消毒7分钟，随后同样用无菌水冲洗5次，冲洗完毕后，将无菌的带芽茎段置于无菌水中备用；

(3)腋芽的萌动与生长：将消毒后的带芽茎段接种至腋芽生长培养基(ms+2.2mg/l6-ba+0.7mg/liba+蔗糖30g/l+琼脂10g/l)上进行培养(培养温度28℃，光周期为12小时光照12小时黑暗)；培养2-3天后，腋芽开始萌动生长；

(4)丛生芽的诱导：带芽茎段培养7-10天后，截取萌发的带2-3mm新生幼嫩茎段的腋芽，转移至丛生芽诱导培养基(1/2ms+2.2mg/l6-ba+0.3mg/lnaa+10ml/l山苍子提取液b+蔗糖30g/l+琼脂10g/l)上进行培养；培养13-15天后，从腋芽基部分化出较多丛生芽；

(5)将丛生芽逐个分离后接种至丛生芽生长培养基(ms+2.2mg/l6-ba+0.7mg/liba+蔗糖30g/l+琼脂10g/l)上培养1周后，芽长势良好，可用于后续培养。

本实施例中，山苍子丛生芽的诱导率达到了93.56％，增值系数达到了13.69。

实施例7山苍子提取液在山苍子组织培养中的应用

(1)外植体的预处理：2019年5月初于湖南省株洲市虎踞镇采集野生山苍子春稍带芽茎段，将采集的带芽茎段用洗洁精或洗衣粉洗涤后在流水下冲洗9小时，随后置于5℃的低温中预处理10小时；

(2)外植体的消毒：在无菌操作台内，将低温预处理后的带芽茎段置于75％的乙醇中消毒12秒后，用无菌水冲洗5次，再置于0.1％的升汞溶液中消毒6分钟，随后同样用无菌水冲洗5次，冲洗完毕后，将无菌的带芽茎段置于无菌水中备用；

(3)腋芽的萌动与生长：将消毒后的带芽茎段接种至腋芽生长培养基(ms+2mg/l6-ba+0.6mg/liba+蔗糖28g/l+琼脂9g/l)上进行培养(培养温度26℃，光周期为12小时光照12小时黑暗)；培养2-3天后，腋芽即开始萌动生长；

(4)丛生芽的诱导：带芽茎段培养7-10天后，截取萌发的带2-3mm新生幼嫩茎段的腋芽，转移至丛生芽诱导培养基(1/2ms+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+8ml/l山苍子提取液c+蔗糖28g/l+琼脂9g/l)上进行培养；培养13-15天后，从腋芽基部分化出较多丛生芽；

(5)将丛生芽逐个分离后接种至丛生芽生长培养基(ms+2mg/l6-ba+0.6mg/liba+蔗糖28g/l+琼脂9g/l)上培养1周后，芽长势良好，可用于后续培养。

本实施例中，山苍子丛生芽的诱导率达到了95.62％，增值系数达到了13.92。

实施例8山苍子提取液在山苍子组织培养中的应用

本实施例与实施例7的不同点仅在于步骤(4)中丛生芽诱导培养基，本实施例中丛生芽诱导培养基为1/2ms+2mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+8ml/l山苍子提取液d+蔗糖28g/l+琼脂9g/l。

本实施例中，腋芽在丛生芽诱导培养基上培养7-10天后，从腋芽基部分化出丛生芽；山苍子丛生芽的诱导率为85.16％，增值系数为9.29。

实施例9对比实施例

本实施例与实施例5的不同点仅在于步骤(4)中丛生芽诱导培养基，本实施例中丛生芽诱导培养基为1/2ms+1.7mg/l6-ba+0.1mg/lnaa+蔗糖25g/l+琼脂8g/l。

本实施例中，腋芽在丛生芽诱导培养基上培养13-15天后，从腋芽基部分化出的丛生芽，如图2中的a图所示，其丛生芽较少；山苍子丛生芽的诱导率为72.86％，增值系数为6.58。

综上，与现有的山苍子丛生芽的诱导方法相比，本发明通过调节各培养基中的激素种类、用量和使用比例，以及在丛生芽诱导培养基中添加本发明提供的山苍子提取液的技术措施，优化了山苍子腋芽生长和丛生芽诱导所用的培养基配方，从而显著提高了以山苍子带芽茎段作为外植体时的丛生芽诱导效率。山苍子提取液在提高丛生芽诱导效率的过程中起到了关键作用，如图2所示，将生长状态一致的腋芽分别接种于不添加和添加了山苍子提取液的丛生芽诱导培养基上培养相同时间后，在含有山苍子提取液的诱导培养基上生长的腋芽，其丛生芽的诱导数量和生长速度都明显优于在不含山苍子提取液的诱导培养基上生长的腋芽。本发明中，山苍子丛生芽的诱导率从之前的60％-80％提高到92.38±5.66％，增值系数从之前的5.6-8.0提高到13.29±1.39，增值周期从30-40天缩短为20-25天，因此，本发明的实施显著提高了山苍子丛生芽的诱导率和增值系数，提高了山苍子离体快繁的效率，促进了山苍子产业的发展，具有较高的市场价值。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。