一种促进油松体细胞胚胎发育成熟的培养方法与流程

本发明涉及一种植物组织培养的方法，特别涉及一种促进油松体细胞胚胎发育成熟的培养方法，属于林业行业中的细胞工程种苗繁育技术领域。

背景技术：

油松(pinustabulaeformisc.)，又称红皮松、短叶松等等，隶属于松科松属的针叶常绿乔木，树高可达30m，胸径达1m，树皮多为灰褐色，表面常常皲裂为鳞状，针叶通常为2针一束，边缘有细小锯齿，长度为9-14cm，幼年时期为浅绿色，后为深绿色，质地坚硬，小枝较粗，为黄褐色，具有微量的树脂，树枝通常向下斜展或平展，成年期树冠较平顶，叶鞘初呈淡褐色，逐渐变成黑褐色，油松球果呈卵圆形或卵形，长3-8cm，有短梗，雄球花为圆柱形，常在新枝下部聚生为穗状，长1.3-1.8cm，花期为4-5月，第二年10月球果成熟。

针叶树繁育中常运用的营养繁殖方式主要有扦插，嫁接等。扦插是植物培育中一种常规且有效的方法。油松的繁育主要采用播种育苗方法，种子主要由种子园提供。虽然我国已经有一些油松种子园，但是耗时长、前期需要投入大量人力财力，结实晚，种子产量和品质不稳定，病虫害严重等是当前种子园普遍存在的问题。另一方面，油松的扦插和嫁接技术存在着强烈的年龄效应。扦插生根率低，嫁接成活效率低，这给油松良种繁育带来很大问题，不能满足生产的要求，极大的限制了油松良种的推广和应用，影响了造林质量。

油松良种繁育技术的相对滞后，影响了油松的生产和科学研究进展。组织培养是目前植物繁育应用广泛的一种方式，是实现林木遗传转化及转基因技术的基础，被认为是针叶树最具潜力的良种繁殖的方法和手段，而体细胞胚胎发生技术是目前最先进的植物无性繁殖方法。

油松体胚体系的相关研究较少，相关研究报道基本集中在器官发生离体培养研究方面，而针对油松体细胞胚发生的研究很少。发明专利“一种油松体细胞胚发生与植株再生方法”(专利号zl201410573714.1)公开了一种油松体细胞胚胎发生和植株再生方法，包括1)采集油松球果并进行表面灭菌，获得无菌合子胚；2)将无菌合子胚接种到胚性组织诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养；3)将获得的胚性组织接种于体细胞胚成熟培养基上，进行体细胞胚的发育成熟培养；4)将成熟的体细胞胚接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗；5)将体胚苗进行炼苗、移栽。该方法通过诱导胚性组织的途径获得了大量稳定生长的油松体细胞胚胎，并获得完整小植株。

现有的油松体胚研究主要存在如下技术缺陷：(1)油松胚性细胞系的数量有限，能生产大量体胚的基因型较少；(2)体胚成熟效果不稳定，影响体胚的成熟效率。这些问题都限制着油松体细胞胚胎技术的发展和在大规模扩繁中的应用。

技术实现要素：

本发明的首要目的是为克服现有技术的不足即从胚性较弱的基因型材料(油松)获得成熟体细胞胚胎困难，提供一种新的促进油松体细胞胚胎(体胚)发育成熟的培养方法。本发明方法促进体胚成熟，增加体胚数量，提高体胚品质及体胚萌发率，可用于规模化、工厂化生产。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种促进油松体细胞胚胎(体胚)发育成熟的培养方法，包括对油松胚性组织进行前处理培养，其中胚性组织前处理的培养基中含有多胺合成抑制剂类的调节剂。

其中，所述油松胚性组织由油松外植体经诱导培养获得，其中所述诱导培养的培养基为mlv培养基+2，4-d2-4mg/l+6-ba1-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖10-30g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l，优选为mlv培养基+2，4-d4mg/l+6-ba2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖20g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l。

特别是，所述诱导培养的培养条件为：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为50-60天。

尤其是，所述油松外植体选择油松雌配子体、合子胚。

其中，所述多胺合成抑制剂为mgbg(methylglyoxalbis-guanylhydrazone；米托胍腙)。

特别是，所述胚性组织前处理培养基中多胺合成抑制剂mgbg的浓度为30-300μm，优选为50-200μm。

其中，所述胚性组织前处理培养基是mlv培养基+mgbg30-300μm+aba0-100μm+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖10-40g/l+蔗糖10-40g/l+谷氨酰胺500mg/l，优选为mlv培养基+mgbg50-200μm+aba20-40μm+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖20-30g/l+蔗糖10-20g/l+谷氨酰胺500mg/l，进一步优选为mlv培养基+mgbg50-200μm+aba30μm+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖20-30g/l+蔗糖10-20g/l+谷氨酰胺500mg/l.

尤其是，所述胚性组织前处理的培养条件为：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为1-2周。

特别是，还包括对将前处理培养胚性组织接种于胚胎成熟培养基上，进行体细胞胚成熟培养，其中所述胚胎成熟培养基中含有多胺合成抑制剂类调节剂。

其中，所述胚胎成熟培养基中含有的多胺合成抑制剂为mgbg。

特别是，所述胚胎成熟培养基中多胺合成抑制剂mgbg的浓度为30-150μm，优选为50-100μm。

其中，所述胚胎成熟培养基是mlv培养基+mgbg30-150μm+aba30-80μm+peg400050-90g/l+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺200-500mg/l+植物凝胶4-7g/l，优选为mlv培养基+mgbg50-100μm+aba50-70μm+peg400050-90g/l+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺200-500mg/l+植物凝胶4-7g/l，进一步优选为mlv培养基+mgbg50-100μm+aba60μm+peg400075g/l+水解酪蛋白500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺200mg/l+植物凝胶5-6g/l。

特别是，所述胚胎成熟培养的培养条件为：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为6-12周。

本发明使用液体前处理并在前处理培养基和胚胎成熟培养基里添加mgbg的方法以达到抑制胚性组织在胚胎成熟过程中的过量增殖，促进体胚的发育和成熟的目的。使用本发明的方法能从胚性较弱的油松基因型材料中得到相对较多的成熟体胚和体胚苗。

本发明另一发明提供一种促进油松体细胞胚胎发育成熟的培养方法，包括如下顺序进行的步骤：

1)将油松无菌合子胚(雌配子体内)接种到诱导培养基中，进行胚性组织诱导培养，获得胚性组织；

2)将胚性组织接种于胚性组织前处理培养基中，进行胚性组织前处理培养，获得经前处理培养过的胚性组织，其中所述胚性组织前处理培养基中含有mgbg；

3)将前处理培养后的胚性组织接种于胚胎成熟培养基上，进行体胚成熟培养，获得成熟体细胞胚胎。

油松的外植体胚龄对胚性组织的诱导率影响显著，过嫩或过熟的合子胚均不能得到理想的胚性组织诱导结果。本发明按照专利“一种油松体细胞胚发生与植株再生方法”(专利号zl201410573714.1)采集油松未成熟种子，其在诱导培养基上的诱导率高。

步骤1)中所述无菌合子胚(雌配子体内)按照专利号zl201410573714.1的发明专利方法制备。

其中，步骤1)中所述胚性组织诱导培养基是mlv培养基+2，4-d2-4mg/l+6-ba1-2mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖10-30g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l。

特别是，步骤1)中所述胚性组织诱导培养的培养条件如下：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为10-20天。

尤其是，胚性组织诱导培养过程中每20-25天继代培养一次；

特别是，还包括对胚性组织进行继代培养，每2-4周继代培养一次。

尤其是，胚性组织继代培养基为：mlv培养基+2，4-d0.2-2mg/l+6-ba0.1-1mg/l+水解酪蛋白500mg/l+谷氨酰胺500mg/l+蔗糖10-30g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l。

特别是，继代培养的培养条件为：黑暗条件，培养温度(25±2)℃；培养时间为2-4周。

特别是，还包括步骤1a)，将步骤1)培养获得的胚性组织接种到增殖培养基上，进行胚性组织增殖培养，获得增殖胚性愈伤组织后再接种到胚性组织前处理培养基中，进行所述的胚性组织前处理培养。

其中，步骤1a)中所述胚性组织增殖培养包括如下步骤：

1a-1)将胚性组织接种到胚性组织固体增殖培养基上进行油松胚性组织的第一阶段固体增殖培养；

1a-2)将进行了第一阶段固体增殖培养后的胚性组织接种到胚性组织液体增殖培养基中，进行油松胚性组织的第二阶段液体增殖培养，获得经液体培养增殖的胚性组织。

特别是，步骤1a-1)中所述胚性组织增殖固体培养基是mlv培养基+2，4-d0.2-2mg/l+6-ba0.1-1mg/l+水解酪蛋白500mg/l+蔗糖10-30g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l+谷氨酰胺500mg/l，优选为mlv培养基+2，4-d0.5-2mg/l+6-ba0.25-1mg/l+水解酪蛋白500mg/l+蔗糖10-20g/l+植物凝胶2.5-3.0g/l+谷氨酰胺500mg/l。

特别是，步骤1a-2)中所述胚性组织液体增殖培养基是mlv培养基+2，4-d0.2-2mg/l+6-ba0.1-1mg/l+水解酪蛋白500mg/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺500mg/l，优选为mlv培养基+2，4-d0.5-2mg/l+6-ba0.25-1mg/l+水解酪蛋白500mg/l+蔗糖10-20g/l+谷氨酰胺500mg/l。

尤其是，所述胚性组织固体增殖培养、液体增殖培养的培养条件如下：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为6-8周；所述液体增殖培养转速为100-120转/分钟。

特别是，胚性组织固体增殖培养过程中每3-4周继代培养一次；继代培养次数为2-3次；胚性组织液体增殖培养过程中每周继代培养一次；继代培养次数为1-2次。

其中，步骤2)中所述胚性组织前处理培养基中mgbg的浓度为30-300μm，优选为50-200μm。

特别是，步骤2)中所述胚性组织前处理培养基是mlv培养基+mgbg30-300μm+aba0-100μm+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖10-40g/l+蔗糖10-40g/l+谷氨酰胺500mg/l，优选为mlv培养基+mgbg50-200μm+aba20-40μm+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖20-30g/l+蔗糖10-20g/l+谷氨酰胺500mg/l，进一步优选为mlv培养基+mgbg50-200μm+aba30μm+水解酪蛋白500mg/l+麦芽糖20-30g/l+蔗糖10-20g/l+谷氨酰胺500mg/l。

特别是，步骤2)中所述胚性组织前处理培养的培养条件如下：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为1-2周。

尤其是，胚性组织前处理培养过程中接种量为每100ml胚性组织前处理培养基中接种胚性组织2-6g。

其中，步骤3)中所述胚胎成熟培养基中含有调节剂mgbg。

特别是，所述胚胎成熟培养基中调节剂mgbg的浓度为30-150μm，优选为50-100μm。

其中，步骤3)中所述胚胎成熟培养基是mlv培养基+mgbg30-150μm+aba30-80μm+peg400050-90g/l+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺500mg/l+植物凝胶4-7g/l，优选为mlv培养基+mgbg50-100μm+aba50-70μm+peg400050-90g/l+水解酪蛋白200-500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺500mg/l+植物凝胶4-7g/l，进一步优选为mlv培养基+mgbg50-100μm+aba60μm+peg400075g/l+水解酪蛋白500mg/l+麦芽糖30-40g/l+蔗糖10-30g/l+谷氨酰胺500mg/l+植物凝胶5-6g/l。

特别是，步骤3)中所述胚胎成熟培养的培养条件如下：黑暗条件下，培养温度为25±2℃；培养时间为8-12周。

本发明又一方面提供一种油松的繁殖方法，包括对油松胚性组织进行胚性组织前处理培养，其中胚性组织前处理培养基中含有多胺合成抑制剂类的调节剂。

其中，所述胚性组织前处理培养基中含有多胺合成抑制剂类的调节剂为mgbg。

特别是，还包括对前处理培养胚性组织进行体细胞胚成熟培养，其中所述胚胎成熟培养基中含有多胺合成抑制剂类调节剂mgbg。

本发明再一方面提供一种油松的繁殖方法，包括如下顺序进行的步骤：

a)将油松无菌合子胚(雌配子体内)接种到诱导培养基上，进行胚性组织诱导培养，获得胚性组织；

b)将诱导培养获得的胚性组织接种到增殖培养基上，进行胚性组织的增殖培养；

c)将增殖培养后的胚性组织接种于胚性组织前处理培养基中，进行胚性组织前处理培养，其中所述胚性组织前处理培养基中含有调节剂mgbg；

d)将经前处理培养过的胚性组织，接种于胚胎成熟培养基上，进行体细胞胚胎成熟培养，获得体细胞胚胎；

e)将成熟的体细胞胚胎接种于萌发培养基中进行萌发培养，获得体胚苗(容器苗)；

f)对体胚苗进行炼苗、移栽，即得。

其中，步骤e)中所述萌发培养基是mlv基本培养基+活性炭1g/l+蔗糖10-20g/l+琼脂7-8g/l。

特别是，步骤e)中所述萌发培养在以下条件下进行：光照条件下，培养温度为25±2℃。

尤其是，步骤e)中所述萌发,转苗培养的培养时间为40-60天；光照强度为1500-2000lux，光照周期为16h光照/8h黑暗。

将容器体胚苗经过炼苗、移栽得到油松幼苗。其炼苗、移栽方法与专利号zl201410573714.1公开的方法相同。

在植物体细胞胚胎发生过程中，胚性组织的增殖与体胚的发育成熟是连续的两个不同阶段。前者是促进胚性组织的增多，后者是为了得到更多的成熟体胚。本发明方法中胚性组织增殖培养基中的2，4-d和6-ba能促进胚性组织的增殖，而在体胚的成熟培养过程中，胚性组织的继续增殖会阻碍体胚的发育和成熟。直接将增殖培养中的胚性组织移至成熟培养基会造成胚性组织的持续增殖，阻碍体胚的发育。而胚性组织在成熟培养时的持续增殖主要是由于胚性组织中残留的2，4-d和6-ba引起的。本发明的胚性组织的液体前处理培养基中不含2，4-d和6-ba，经过对胚性组织的前处理悬浮培养，能有效地去除组织中残留的2，4-d和6-ba；同时在前处理培养基中添加入mgbg能进一步抑制胚性组织由于其它原因造成的过量增殖，为下一步体胚的成熟培养创造更好的条件；而且在液体前处理和胚胎成熟培养基里添加mgbg能进一步有效地促进体胚的发育和成熟，获得更多更好的成熟体胚，从而为后续的体胚萌发，体胚苗生长提供了良好的条件。

本发明的油松繁殖再生方法具有以下优点：

1、本发明利用油松幼嫩的合子胚(雌配子体内)作为外植体进行植株再生繁殖，对胚性组织进行增殖培养后，在对胚性组织进行前处理培养以及后续的体细胞胚胎成熟培养过程中，前处理培养基、成熟培养基中均添加mgbg，抑制油松胚性组织过量增殖，本发明在体细胞胚胎发生之前对胚性组织的增殖进行抑制处理，减少胚性组织的过多增殖，促进体细胞胚胎的萌发，为体细胞胚胎的成熟培养创造更好条件；在成熟培养基中添加mgbg促进体细胞胚胎的成熟，提高萌发的体细胞胚胎的质量和品质，获得更多的高质量的成熟体胚，进而提高体胚苗的萌发率，为体胚苗生长提供了良好的条件。

mgbg(methylglyoxalbis-guanylhydrazone，中文名称：米托胍腙(甲基乙二醛双脒基腙))是植物组织内多胺合成的抑制剂。多胺能促进胚性组织的增殖并有利于植物体胚的产生，例如精胺。在现有针叶树体胚培养过程中并不使用mgbg，因为学术界普遍认为抑制多胺的合成也会阻碍体胚的发育。本发明证明在液体前处理和胚胎成熟培养基里添加适量的mgbg能减少胚性组织的过量增殖，促进体胚的发育和成熟。使用添加mgbg的新方法能获得更多的高质量成熟体胚，从而为后续的体胚萌发，体胚苗生长提供良好的条件。本发明特别适用于从胚性较弱，植物组织增殖过量的油松基因型材料中得到相对更多的成熟体胚和体胚苗。

2、本发明的油松繁殖方法中添加的mgbg是多胺合成抑制剂，能减少多胺的合成量，显著抑制成熟培养中胚性组织的过量增殖。本发明通过对胚性组织的悬浮前处理以及在成熟培养基中添加适量浓度的mgbg能够明显的抑制胚性组织的增殖，并且体胚在添加适当浓度的mgbg培养基中能够良好地生长和发育成为形态，功能正常的成熟体胚。本发明不同于现有技术在于使用适量的多胺合成抑制剂以促进体胚发育成熟，而一般研究认为多胺有利于植物体胚的产生，因此在针叶树体胚培养的方法中并不使用mgbg，以避免减少内源多胺的合成。

附图说明

图1是油松胚性组织。

图2是油松胚性组织液体增殖培养阶段的胚性组织、胚性组织结构，其中a为体式显微镜下观察到的胚性组织；b、染色后显微镜下观察到的胚性组织结构，其中s指胚柄,em指胚体。

图3是油松胚性组织前处理培养1周后的胚性组织生长状态对比。

图4是油松胚性组织在成熟培养基上的成胚状况，其中a和b为在含有mgbg成熟培养基上体胚的生长发育状况：a显示在油松胚性组织中发育出数个类似原胚阶段的体胚；b为子叶出现前的未成熟体胚；c为体式显微镜下观察到的油松成熟体胚。

图5培养基中不同浓度的mgbg对油松正常成熟体胚数量的影响。其中横坐标表示成熟培养基中mgbg的浓度(μm)；图右侧小方格所示0、50、100、200分别表示前处理培养基中mgbg的浓度(μm)。

图6四个不同处理的胚性组织在含有mgbg成熟培养基上(1周)的生长状况对比。

图7四个不同处理的胚性组织在含有mgbg成熟培养基上(6周)的生长状况对比。

图8为油松体细胞胚胎萌发培养的体胚苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1

一、试验材料

1、油松未成熟的球果

本发明于2017年以山西吕梁国有林业管理局国家油松良种基地为取材地点，选取生长健康，无病虫害，球果结实率高，自由授粉的油松，采集散粉后51天的球果100个，将采集的球果保存在4℃环境中冷藏，备用。

2、植物生长调节剂

本发明中所使用的植物生长调节物质采用国产6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)、2，4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)、吲哚丁酸(iba)、萘乙酸(naa)、脱落酸(aba)、mgbg(methylglyoxalbis-guanylhydrazone；米托胍腙；甲基乙二醛双脒基腙)。

3、培养基

(1)mlv培养基

表1mlv培养基配方

mlv基本培养基(kongl,vonaderkasp.2007.genotypeeffectsonabaconsumptionandsomaticembryomaturationininteriorspruce(piceaglaucaxengelmanni).journalofexperimentalbotany58:1525–1531)是根据lv基本培养基配方(litvayjd,vermadc,johnsonma.1985.influenceofloblollypine(pinustaedal.)culturemediumanditscomponentsongrowthandsomaticembryogenesisofthewildcarrot(daucuscarotal.).plantcellreports4:325–328)优化而成。

(2)胚性组织诱导培养基：mlv培养基中添加2，4-d2-4mg/l、6-ba1-2mg/l、水解酪蛋白500mg/l、蔗糖10-30g/l、植物凝胶2.5-3.0g/l、谷氨酰胺500mg/l，调节ph值为5.8，在121℃下恒温灭菌20分钟。待培养基冷却到50℃左右，在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，加入到培养基中混合摇匀。

(3)胚性组织固体增殖培养基：mlv培养基中添加2，4-d0.2-2mg/l、6-ba0.1-1mg/l、水解酪蛋白500mg/l、蔗糖10-30g/l、植物凝胶2.5-3.0g/l、谷氨酰胺500mg/l，调节ph值为5.8，在温度121℃下恒温灭菌20分钟。在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，待培养基冷却到50℃左右，加入到培养基中混合摇匀。

(4)胚性组织液体增殖培养基：mlv培养基中添加2，4-d0.2-2mg/l、6-ba0.1-1mg/l、水解酪蛋白500mg/l、蔗糖10-30g/l、谷氨酰胺500mg/l，调节ph值为5.8，在121℃下恒温灭菌20分钟。在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，待培养基冷却到50℃左右，加入到培养基中混合摇匀。

(5)胚性组织前处理培养基：mlv培养基中添加mgbg50-200μm、aba20-40μm、水解酪蛋白200mg/l、谷氨酰胺500mg/l、麦芽糖20-30g/l、蔗糖10-20g/l，调节ph值为5.8，在121℃下恒温灭菌20分钟。在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，aba和mgbg，待培养基冷却到50℃左右，加入到培养基中混合摇匀。

(6)胚胎成熟培养基：mlv培养基中添加mgbg50-100μm、aba50-70μm、peg400050-90g/l、水解酪蛋白200-500mg/l、谷氨酰胺500mg/l、麦芽糖30-40g/l、蔗糖10-30g/l、植物凝胶4-6g/l，调节ph值为5.8，在121℃下恒温灭菌20分钟。在超净工作台中过滤灭菌谷氨酰胺，aba和mgbg，待培养基冷却到50℃左右，加入到培养基中混合摇匀。

(7)体细胞胚胎萌发培养基mlv基本培养基中添加活性炭1-2g/l、蔗糖10-20g/l、琼脂8g/l，调节ph值为5.8，在121℃下恒温灭菌15分钟。

实施例2

1、外植体的灭菌

外植体灭菌方法与专利号zl201410573714.1公开的方法相同。

将于4℃储藏的散粉后第51天的油松球果先用洗洁精洗去球果表面的油污，接着用自来水洗净后剖开球果，取出种子；然后在超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精浸泡油松球果种子30-60s，而后捞取种子用无菌水冲洗数次(3-5次)，然后放入质量分数为0.1％的hgcl2溶液里浸泡5-10min，捞取种子后再用无菌水冲洗数次(5-6次)，将冲洗干净的种子放在高温高压灭菌后的滤纸上吸去水分，用镊子和剪刀打开种皮，获得雌配子体(含未成熟的合子胚)，备用。

2、胚性组织诱导培养

胚性组织诱导培养与专利号zl201410573714.1公开的相同。

在超净工作台中将表面灭菌的开花散粉后51天的油松未成熟合子胚作为外植体接种于胚性组织诱导培养基中，在黑暗条件下进行胚性组织的诱导培养，每20天继代培养一次，其中，培养温度为(25±2)℃，胚性组织诱导培养基中所用2,4-d为2mg/l、6-ba为1mg/l，天然复合物水解酪蛋白500mg/l，谷氨酰胺500mg/l，蔗糖30g/l，植物凝胶2.8g/l，诱导培养约15天后，从珠孔端长出胚性组织；培养60天左右能形成直径1cm的胚性细胞团，如图1。

3、胚性组织增殖培养

3-1)胚性组织固体增殖培养

胚性组织固体增殖培养与专利号zl201410573714.1公开的方法相同。

将胚性组织接种到胚性组织固体增殖培养基上，在黑暗条件下进行油松胚性组织的第一阶段固体增殖培养，其中，培养温度为(25±2)℃，胚性组织固体增殖培养基中所用2,4-d为1.0mg/l，6-ba为0.5mg/l，水解酪蛋白500mg/l，谷氨酰胺500mg/l，蔗糖20g/l，植物凝胶2.8g/l，在油松胚性体细胞胚胎固体增殖培养过程中每3-4周继代一次，继代培养2次后，获得大量半透明的油松胚性组织，如图1。

固体增殖培养基中2，4-d的浓度除了2mg/l之外，2，4-d的浓度为0.2-2mg/l均适用于本发明；6-ba的浓度除了1mg/l之外，6-ba的浓度为0.1-1mg/l均适用于本发明。

固体增殖培养后得到的胚性组织呈半透明、松散、颗粒状结构。在体视显微镜下可以看到许多丝状突起的小胚胎，包括小胚的胚头和胚柄的结构。

3-2)胚性组织液体增殖培养

将第一阶段固体增殖培养获得的胚性组织以样本量为5-10g，接种于100ml的胚性组织液体增殖培养基中，在黑暗条件下进行油松胚性组织的第二阶段液体增殖培养，其中，培养温度为(25±2)℃，胚性组织液体增殖培养基中所用2,4-d为1.0mg/l，6-ba为0.5mg/l，水解酪蛋白500mg/l，谷氨酰胺500mg/l，蔗糖20g/l，在油松胚性体细胞胚胎液体增殖培养过程中每周继代一次，继代培养以保持培养基内含有充足的养料和水分，继代培养2次后，统计液体增殖胚性组织的生长状况、增殖率和形态，可以看到胚性组织与液体培养基的明显分层，获得大量半透明、松散、颗粒状结构的油松胚性增殖胚性组织。在体式显微镜下观察的胚性组织如图2a所示；卡宝品红(dz0040；leagene)染色后在显微镜下观察胚性组织结构，可以清楚的看到胚体和胚柄的分化(如图2b)。

液体增殖培养基中2，4-d的浓度除了2mg/l之外，2，4-d的浓度为0.2-2mg/l均适用于本发明；6-ba的浓度除了1mg/l之外，6-ba的浓度为0.1-1mg/l均适用于本发明。

实施例3胚性组织的前处理培养

将液体增殖培养后的半透明状、表面呈颗粒或细丝状的增殖培养的胚性组织2g(通常为2-5g)，接种于100ml锥形瓶中，锥形瓶中加入30-40ml的胚性组织前处理培养基，在黑暗条件下，于锥形瓶内悬浮培养，即进行油松胚性组织前处理培养，其中培养温度为(25±2)℃，胚性组织前处理培养基中所用mgbg的用量如表2所示，aba30μm、水解酪蛋白500mg/l，谷氨酰胺500mg/l，蔗糖10g/l，麦芽糖20g/l，将锥形瓶放置100r·min^–1，25℃的恒温摇床上黑暗处理1周，每个试验重复3次，并设置空白对照，观察并记录胚性组织的生长状况和形态。

增殖率(％)＝鲜重增加量(g)/初始接种量(g)*100

前处理培养后1周后的胚性组织生长状况和形态观察结果如图3，其中a为左侧锥形瓶培养基中没有添加mgbg，胚性组织在增殖后量较多；而b为右侧锥形瓶中mgbg浓度为200μm，瓶内胚性组织在增殖后的量较对照(无mgbg)少，瓶内胚性组织增殖量有明显的差异，添加mgbg的培养基中胚性增殖量明显降低，结果表明mgbg在悬浮培养中对胚性组织的增殖起到了一定的抑制作用。另外，经前处理培养后，在添加mgbg的培养基中培养的胚性组织中有较多的相当于原胚的微小体胚，体胚结构正常，胚体和胚柄清楚。

本发明进行胚性组织的前处理培养过程中，除了使用增殖培养后的胚性组织之外，也可以将诱导培养获得的胚性组织直接进行前处理培养。

实施例4胚性组织的成熟培养

将前处理培养1周(通常为1-2周)后的胚性组织取出，置于成熟培养基上，并称量培养基与胚性组织的整体质量。在黑暗条件下，进行油松胚性组织的胚胎成熟培养，其中培养温度为(25±2)℃。

胚性组织成熟培养基中所用mgbg的用量如表2所示，aba60μm、聚乙二醇(peg4000)75g/l、水解酪蛋白500mg/l，谷氨酰胺500mg/l，麦芽糖30g/l、蔗糖10g/l。黑暗培养，每个试验重复3次，每周称量成熟培养基与胚性组织的整体质量。

确定胚性组织增殖量的方法为先称量初期带有胚性组织的成熟培养基重量记为w0，一周后再次称量整个成熟培养基的重量，记为w1，w1与w0的差值，即为这一周之内胚性组织增殖的重量，以此类推(此处在培养过程中培养基中失去的水分忽略不计)，统计每周胚性组织的增殖量。培养6-8周以后，可以观察到体细胞胚胎由早期未成熟体胚发育到子叶胚阶段，获得成熟体细胞胚胎。

6-8周以后对每盘内的成熟胚的数量进行统计，结果如图5，其中横坐标表示成熟培养基中mgbg的浓度；图右侧小方格所示0、50、100、200分别表示前处理培养基中mgbg的浓度(μm)。

显微镜下观察到的含有mgbg成熟培养基中成熟胚的生长状况，如图4；其中a和b为含有mgbg成熟培养基中体胚的生长状况；c为体式显微镜下观察到的油松成熟体胚。图中标尺为1毫米。

表2mgbg浓度对胚性组织成熟的影响

由表2可得知，在胚性组织前处理培养和胚胎成熟培养中都未添加mgbg处理的胚性组织，其增殖量在整个培养过程中远远高于其他处理组，而在添加了mgbg的其他处理组，胚性组织的增殖量有明显的减少；随着mgbg浓度的增加，胚性组织的增殖量逐渐降低，增加到一定浓度后胚性增殖量缓慢增加。说明当mgbg浓度达到一定的值后，对胚性组织的增殖有抑制作用，所以在试验中要找到最适宜的浓度。

由表2可知，mgbg对胚性组织增长量有明显的抑制作用，并且虽然胚性组织的增殖得到抑制，但是成熟胚的数量却显著的提高，如图3。

从图5可知，在三组处理中，随着胚性组织前处理培养基中mgbg溶液浓度的增加，成熟胚的数量逐渐增多，但是，当前处理培养基中mgbg的浓度为200μm时，成熟体细胞胚胎的数量减少，低于mgbg浓度为100μm的成熟体胚的数量；其中当成熟培养基中mgbg溶液浓度为50μm时(图5中第2组处理)，成熟胚的数量最多。

当前处理培养基中的mgbg溶液浓度为100μm，成熟培养基中mgbg溶液浓度为50μm时成熟胚的数量都达到最高，说明在前处理培养基中mgbg溶液浓度为100μm时，是一个合适的液体悬浮前处理浓度，比较适宜胚性组织向成熟阶段生长发育的转变，并且结合表2可知，在此处理下，胚性组织的增殖量也明显降低，所以说明mgbg溶液对胚性组织的增殖有抑制作用，并在一定程度上对胚性组织胚性发展和胚性组织向成熟阶段的生长发育有促进作用。

从图5中可以看到，完全无mgbg处理的油松胚性组织只能产生很少量的正常成熟体胚，而使用了适当浓度mgbg(前处理培养100/成熟培养50)的处理后，正常成熟体胚的数量增加了10倍(图5)。体胚总数也增加了10倍以上。

不论在前处理培养还是成熟培养中，当mgbg浓度达到一定浓度(200μm)时，成熟胚数量增加不明显，胚性组织增殖量虽然在减少，但生长状态不健康，组织水状，粘结不松散，硬化且褐化速度加快。说明过量的mgbg不适合胚性组织的增殖和成熟发育。根据本试验的结果，综合考虑成胚的效果和质量，选择前处理培养时mgbg浓度为100μm，成熟培养时50μm时效果最好。

其中：本实施例中成熟培养的4个处理(a、b、c、d)在成熟培养处理1周、6周后的胚性组织状态分别如图6、7所示，其中处理1周的胚性组织的生长状况如图6，处理6周的胚性组织的生长状况如图7，其中：

a处理为胚性组织前处理培养过程中mgbg浓度为0μm，体细胞胚胎成熟培养过程中mgbg的浓度为0μm；

b处理为胚性组织前处理培养过程中mgbg浓度为50μm，体细胞胚胎成熟培养过程中mgbg的浓度为0μm；

c处理为胚性组织前处理培养过程中mgbg浓度为100μm，体细胞胚胎成熟培养过程中mgbg的浓度为50μm；

d处理为胚性组织前处理培养过程中mgbg浓度为200μm，体细胞胚胎成熟培养过程中mgbg的浓度为100μm；

由图6、7可以得知，培养6周后的胚性组织增殖量在每一组处理中都有不同的变化，四种处理在培养初期添加等量的胚性组织，6周后可以明显观察到这四种处理中的胚性组织增殖量逐渐减少，如图7，说明mgbg起到了对胚性组织增殖的部分抑制作用。

对比试验结果表明：mgbg能够明显的抑制成熟培养中胚性组织的过量增殖，为成熟胚的生长提供空间；当悬浮前处理液体培养基和成熟固体培养基中分别加入mgbg母液至100μm、50μm，能够达到明显的抑制胚性组织的增殖的目的，并且成熟胚能够良好的生长和发育。

实施例5体细胞胚胎萌发、体胚苗移栽

将实施例5的处理8中培养的成熟体细胞胚胎从胚性组织上分离下来，转接到体细胞胚胎萌发培养基上，置于25±2℃条件下，在光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为1500-2000lux条件下培养，萌发培养过程中的相对湿度为60-75％，萌发培养基中所述活性炭1g/l，蔗糖10-20g/l，琼脂7g/l，成熟体细胞胚胎子叶很快变绿，下胚轴伸长生长，培养8周后成熟体细胞胚胎的顶端的子叶展开。体胚萌发时，一端分化出根生长端，另一端出现顶芽，形成体胚苗(如图8)。

体细胞胚胎萌发率(％)＝萌发的体细胞胚胎数/接种的体细胞胚胎数×100％

在体细胞胚胎萌发培养过程中，每次处理接种体细胞胚胎10-12个，重复处理3次。体细胞胚胎萌发率为94％，转苗率为72％。

体胚苗长到2厘米高，根较粗壮时，打开培养瓶瓶盖，在移栽室中炼苗培养1天后，取出植株，用自来水洗净试管苗根部残留的琼脂培养基，移栽到油松无土栽培基质(珍珠岩、蛭石，珍珠岩与蛭石的体积之比为1:1)中在移栽室进行容器培养。移苗后一周保持相对湿度为70-90％，培养温度为25±5℃，7-10天后获得油松幼苗。

本发明中如果只进行液体前处理培养，成熟培养基中不添加mgbg，油松胚性组织只能产生很少的正常成熟体胚，如图5所示。

本发明中如果只进行成熟培养，而不进行液体成熟培养的前处理培养，油松胚性组织不能产生正常的成熟体胚。

本发明方法在油松胚性组织增殖培养后转化成体细胞胚胎的过程中，先进行胚性组织的前处理调整培养，然后进行体细胞胚胎的成熟培养，并且在前处理培养基和成熟培养基中均添加多胺合成抑制剂mgbg，避免胚性组织的过度增殖；对胚性组织的增殖进行抑制处理，减少胚性组织的过多增殖，为体细胞胚胎的成熟培养创造更好条件，获得更多的高质量的成熟体细胞胚胎，进而提高体胚苗的产出率。本发明的油松繁殖方法为油松多基因型大规模无性育苗提供一种有效的方法。