本申请是对申请日2016.10.14日，申请号201610900215.8，发明名称“一种灵芝的栽培方法”的发明专利申请的分案申请。
本发明属于药用真菌人工栽培技术领域，具体涉及一种灵芝的栽培方法。
背景技术：
灵芝(ganodermalucidumkarst)是多孔菌科真菌灵芝的子实体。具有补气安神、止咳平喘、延年益寿的功效。用于眩晕不眠、心悸气短、神经衰弱、虚劳咳喘。灵芝是我国医学宝库中的一种名贵中药，是集保健和药用为一身的食用菌。《神农本草经》、《抱朴子》、《本草纲目》等古籍都对其功效作用等均有记载。现代医学研究证明，灵芝中的多糖类、三萜类、甾醇类等活性成分，对人体有抗肿瘤、调节免疫、调节神经系统、调节循环系统等的功能。传统的野外采集或人工栽培生产的子实体(或菌核)收到野生资源稀缺、子实体栽培生产周期长(4-5月)、生产受气候等条件控制和生物活性物质含量低等诸多因素制约，对灵芝的大量生产造成了阻碍。
为了有效开发利用该药用真菌，本发明提供一种灵芝的人工栽培方法。
技术实现要素：
本发明目的是提供一种灵芝的栽培方法，该方法具有菌丝生长速度快，子实体及孢子粉产量高等优点。
本发明技术方案如下：
一种灵芝的栽培方法，包括以下步骤：
1)将灵芝母种接种至母种培养基，获得灵芝母种；
所述母种培养基包括以下成分：马铃薯200-300g/l、葡萄糖20-30g/l、牛肉膏3-5g/l、蛋白胨4-10g/l、琼脂粉15-20g/l；
2)将灵芝母种接种至原种培养基培养，获得灵芝原种；
所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑60-80份、玉米芯5-10份、麦麸10-15份、红糖1-3份、石膏粉1-3份、kno30.05-0.5份；所述原种培养基含水量为55-60％；
3)将灵芝原种接种至栽培种培养基中培养，获得灵芝栽培种；
所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：玉米秸秆50-80份、木屑30-50份、猪粪10-25份、牛粪10-25、菜籽粕5-25份、腐植酸5-10份、蜜环菌(armillariamellea(vahl.exfr.)quel.)发酵液1-10份、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)发酵液1-10份、石膏1-3份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-5.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.5×1010/ml；所述栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：按配比将各原料混合，加水至含水量50-70％，发酵至腐熟；调节水分含量至55-60％，灭菌，即可；
4)将所述灵芝栽培种进行代料栽培，获得灵芝；所述代料栽培的培养基与栽培种培养基相同。
所述获得灵芝包括收获灵芝子实体，或者还包括收获灵芝孢子粉。
优选地，所述母种培养基包括以下成分：马铃薯250g/l、葡萄糖25g/l、牛肉膏3g/l、蛋白胨6g/l、琼脂粉15-20g/l。
优选地，所述母种培养条件包括：在22-26℃下恒温避光培养；一般培养5-7天即可菌丝长满培养基斜面。
优选地，所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑70份、玉米芯6份、麦麸15份、红糖2份、石膏粉1份、kno30.25份；所述原种培养基含水量为55-60％。
优选地，所述原种培养条件包括：在温度为20-22℃、湿度为55-65％下恒温避光培养一般培养35-40天。
优选地，所述栽培种培养基或代料培养基，包括以下重量份的原料：玉米秸秆65份、木屑40份、猪粪15份、牛粪20、菜籽粕15份、腐植酸6份、蜜环菌发酵液5份、枯草芽孢杆菌发酵液5份、石膏1份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-3.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.2×1010/ml。
优选地，所述栽培种培养条件包括：在温度为20-22℃、湿度为55-65％下恒温培养，一般培养35-50天；前期10天内避光培养，后期光照强度为1000-15001x(勒克斯)；有利于菌丝快速生长。
本发明所述母种培养基、原种培养基均可由本领域常规方法制得。
所述代料栽培出菇培养时间一般为30-50d.
优选地，所述代料栽培条件包括：培养温度为28-30℃，空气相对湿度为60-75％，前期10天内避光培养，后期光照强度为1000-15001x(勒克斯)；有利于菌丝快速生长。
本发明还提供一种栽培灵芝的母种培养基，包括以下成分：马铃薯200-300g/l、葡萄糖20-30g/l、牛肉膏3-5g/l、蛋白胨4-10g/l、琼脂粉15-20g/l；优选地，所述母种培养基包括以下成分：马铃薯250g/l、葡萄糖25g/l、牛肉膏3g/l、蛋白胨6g/l、琼脂粉15-20g/l。
本发明还提供一种栽培灵芝的原种培养基，包括以下重量份的成分：木屑60-80份、玉米芯5-10份、麦麸10-15份、红糖1-3份、石膏粉1-3份、kno30.05-0.5份；所述原种培养基含水量为55-60％；优选地，所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑70份、玉米芯6份、麦麸15份、红糖2份、石膏粉1份、kno30.25份；所述原种培养基含水量为55-60％。
本发明还提供一种栽培灵芝的栽培种培养基或代料培养基，包括以下重量份的原料：玉米秸秆50-80份、木屑30-50份、猪粪10-25份、牛粪10-25、菜籽粕5-25份、腐植酸5-10份、蜜环菌(armillariamellea(vahl.exfr.)quel.)发酵液1-10份、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)发酵液1-10份、石膏1-3份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-5.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.5×1010/ml；所述栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：按配比将各原料混合，加水至含水量50-70％，发酵至腐熟；调节水分含量至55-60％，灭菌，即可。
优选地，所述栽培种培养基或代料培养基，包括以下重量份的原料：玉米秸秆65份、木屑40份、猪粪15份、牛粪20、菜籽粕15份、腐植酸6份、蜜环菌发酵液5份、枯草芽孢杆菌发酵液5份、石膏2份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-3.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.2×1010/ml。
所述玉米秸秆优选粉碎或切断至1-3cm以下的小段。
所述腐植酸可市售购得，例如购自山东创新腐植酸科技股份有限公司。
所述枯草芽孢杆菌优选为cgmcc1.3358。
本发明所述蜜环菌、枯草芽孢杆菌均可以通过市售购得，例如购自中国普通微生物菌种保藏中心。
栽培种培养基或代料培养基的制备方法中所述灭菌需要彻底灭活枯草芽孢杆菌及其芽孢等各种微生物，可采用本领域常规灭菌方法。
所述蜜环菌发酵液制备可采用本领域常规方法，例如制备方法包括取蜜环菌母种，接种于培养液，摇床培养5-10d，用纱布滤掉蜜环菌菌球，即得蜜环菌发酵液；可置于冰箱中保存。所述摇床培养转速优选140-160rpm振荡培养，培养温度优选22-26℃；一般250ml三角瓶装培养液量125-150ml，500ml三角瓶装培养液量250-300ml。
所述枯草芽孢杆菌发酵液制备可采用本领域常规方法，例如包括以下步骤：
1)斜面培养：将枯草芽孢杆菌的原始菌种在无菌条件下接种于斜面培养基上，在29±1℃条件下培养36-48h；斜面培养基的配方如下：葡萄糖15g、蛋白胨5g、酵母膏5g、水1000ml、琼脂15g；
2)摇床培养：将步骤1)培养得到的菌种接种于液体培养基，在ph6.5-7.0、温度为30±2℃条件下，140-160r/min摇床培养36-48h；液体培养基配方如下：玉米粉13g，葡萄糖5g，豆饼粉20g，鱼粉5g，caco32g，(nh4)2so41g，k2hpo40.3g，mgso4·7h2o0.2g，mnso4·h2o0.2g，水1000ml；
3)发酵罐培养：将步骤2)培养得到的菌种接种于发酵罐培养基，在ph7.5-8.0、罐压0.5kg、温度为30±2℃、通风量1:0.8-1.1条件下，至菌数大于1.0-1.2×1010/ml时下罐，即得枯草芽孢杆菌发酵液；发酵罐培养基配方如下：玉米粉5kg、豆饼粉2.5kg、硫酸铵0.5kg、葡萄糖1.5kg、酵母粉0.5kg、蛋白胨0.25kg、加水至100kg；通常培养48-56h。
具体地，栽培种培养基或代料培养基的制备方法中所述发酵至腐熟包括：发酵堆内温度达到50℃时第一次翻堆，以后每天翻堆1-2次，并补充适量水分，待发酵堆温度降低至35℃以下、水分含量降至30％以下结束发酵。
本发明所述灵芝优选为灵芝ganodermalucidum(leyss.:fr.)karst；紫芝ganodermasinensej.d.zhao,l.w.hsuetx.q.zhang；薄盖灵芝ganodermacapense(lloyd)d.a.reid。
本发明所述灵芝菌种均可市售购得，也可以从野生灵芝子实体上分离得到。
本发明优化了母种培养基、原种培养基和栽培种培养基，使灵芝菌丝生长更快，更有利于后期形成子实体。特别地，本发明栽培种培养基可显著提高灵芝子实体及孢子粉产量，并且还显著提高了灵芝多糖、灵芝总三萜酸等有效成分的含量。本发明首次将蜜环菌应用到灵芝栽培种培养基堆腐发酵中，所制得的栽培种培养基(也可用作代料培养基)具备抑菌功能，显著降低了杂菌污染率，提高了灵芝质量，增加了经济效益。另外，本发明首次将玉米秸秆用作灵芝栽培中，解决了农作物秸秆的利用难题，拓宽了培养基原料来源，降低了生产成本。采用代料栽培能综合利用农林产品的有机废料，适合在无林地区或少林地区推广使用，并且可以合理安排场地达到良好的经济效益。本发明方法简便易行，投资小、见效快，易于推广；本发明方法菌丝生长速度快，菌丝日均生长速度可达18-20mm/d，子实体生物学效率可达9％-15％，子实体产量高、质量好。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明菌种均可以通过市售购得。以下所述枯草芽孢杆菌为cgmcc1.3358。以下所述玉米秸秆经粉碎或切断至1-3cm以下的小段。
实施例1
一种灵芝的栽培方法，包括以下步骤：
1)将灵芝ganodermalucidum(leyss.:fr.)karst母种接种至母种培养基在22-26℃下恒温培养5-7天养，获得灵芝母种。所述母种培养基包括以下成分：马铃薯250g/l、葡萄糖25g/l、牛肉膏3g/l、蛋白胨6g/l、琼脂粉15-20g/l。
2)将灵芝母种接种至原种培养基在温度20-22℃、湿度55-65％下培养，获得灵芝原种。所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑70份、玉米芯6份、麦麸15份、红糖2份、石膏粉1份、kno30.25份；所述原种培养基含水量为55-60％；原种培养基制成500ml原种瓶。所述原种培养基的制备方法包括按配比取各原料，混匀后调整水分含量，灭菌。
所述母种培养、原种培养条件均在暗室避光培养。
3)将灵芝原种接种至栽培袋内的栽培种培养基中培养，获得灵芝栽培种。所述栽培种培养条件包括在温度为20-22℃、湿度为55-65％下恒温培养，一般培养35-50天；前期10天内避光培养，后期光照强度为1000-15001x(勒克斯)。
所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：玉米秸秆65份、木屑40份、猪粪15份、牛粪20、菜籽粕15份、腐植酸6份、蜜环菌发酵液5份、枯草芽孢杆菌发酵液5份、石膏2份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-3.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.2×1010/ml。所述蜜环菌发酵液制备方法包括取蜜环菌母种，接种于培养液，摇床140rpm培养7-8d，培养温度22-26℃，用纱布滤掉蜜环菌菌球，即得蜜环菌发酵液。
所述栽培种培养基的制备方法包括以下步骤：按配比将各原料混合，加水至含水量50-70％，发酵堆内温度达到50℃时第一次翻堆，以后每天翻堆1-2次，并补充适量水分，待发酵堆温度降低至35℃以下、水分含量降至30％以下表明发酵腐熟，结束发酵；调节水分含量至55-60％，彻底灭菌(即彻底灭活枯草芽孢杆菌及其芽孢等各种微生物)，即可。
4)将所述灵芝栽培种进行代料栽培出菇培养，获得灵芝。所述代料培养基与栽培种培养基相同。所述代料栽培条件包括：培养温度为28-30℃，空气相对湿度为60-75％，前期10天内避光培养，后期光照强度为1000-15001x(勒克斯)。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度均可达18-20mm/d。从原基到子实体成熟一般需30-45d，一般培养后1.5-2个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体90-125kg。孢子粉和子实体产量比为25％-33％。(子实体和孢子粉产量均以干重计，下同。)
实施例2
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：所述母种培养基包括以下成分：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、牛肉膏3g/l、蛋白胨4g/l、琼脂粉15g/l；所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑60份、玉米芯5份、麦麸10份、红糖1份、石膏粉1份、kno30.05份；所述原种培养基含水量为55-60％；所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：玉米秸秆50份、木屑30份、猪粪10份、牛粪10、菜籽粕5份、腐植酸5份、蜜环菌发酵液1份、枯草芽孢杆菌发酵液1份、石膏1份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-2.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.2×1010/ml。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度均可达18-20mm/d。从原基到子实体成熟一般需30-45d，一般培养后1.5-2个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体90-115kg。孢子粉和子实体产量比为44％-52％。
实施例3
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：所述灵芝为紫芝ganodermasinensej.d.zhao,l.w.hsuetx.q.zhang。母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度均可达18-20mm/d。从原基到子实体成熟一般需30-45d，一般培养后1.5-2个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体90-115kg。
实施例4
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：所述母种培养基包括以下成分：马铃薯300g/l、葡萄糖30g/l、牛肉膏5g/l、蛋白胨10g/l、琼脂粉20g/l；所述原种培养基包括以下重量份的成分：木屑80份、玉米芯10份、麦麸15份、红糖3份、石膏粉3份、kno30.3份；所述原种培养基含水量为55-60％；所述栽培种培养基包括以下重量份的原料：玉米秸秆80份、木屑50份、猪粪25份、牛粪25、菜籽粕25份、腐植酸10份、蜜环菌发酵液10份、枯草芽孢杆菌发酵液10份、石膏3份；所述蜜环菌发酵液中有效活菌数为1.0-2.0×106/ml，所述枯草芽孢杆菌发酵液中有效活菌数为1.0-1.2×1010/ml。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度均可达18-20mm/d。从原基到子实体成熟一般需30-45d，一般培养后1.5-2个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体90-120kg。孢子粉和子实体产量比为38％-45％。
实施例5
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：所述灵芝为薄盖灵芝ganodermacapense(lloyd)d.a.reid。母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度均可达18-20mm/d。从原基到子实体成熟一般需30-45d，一般培养后1.5-2个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体90-120kg。
对比例1
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：母种培养基采用pda培养基，包括以下成分：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉15g/l；原种培养基包括以下重量份的成分：阔叶树木屑80份、麦麸18份、蔗糖1份、石膏粉1份，搅拌均匀后加水，最终培养基含水量为55-60％；所述母种培养、原种培养均为22℃-25℃恒温暗室避光培养；所述栽培种培养基与代料栽培培养基相同，包括以下重量份的成分：杂木屑73份，麦麸25份，黄豆粉1份，石膏粉1份。所述代料栽培条件包括：培养温度为25-26℃，空气相对湿度为60-95％，前20d光照强度1000-1500勒克斯，后期光照强度1500-3000勒克斯。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般10-15mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-50d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体45-55kg。孢子粉和子实体产量比为13％-15％。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-13％。
对比例2
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：母种培养基采用pda培养基，包括以下成分：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉15g/l；原种培养基包括以下重量份的成分：木屑80份、玉米芯6份、麦麸18份、石膏粉1份；搅拌均匀后加水，最终培养基含水量为55-60％；所述母种培养、原种培养均为22℃-25℃恒温暗室避光培养。所述栽培种培养基与代料栽培培养基相同，包括以下重量份的成分：棉籽壳78份、麦麸20份、蔗糖1份、石膏1份；所述代料栽培条件包括：培养温度为25-26℃，空气相对湿度为60-95％，前20d光照强度1000-1500勒克斯，后期光照强度1500-3000勒克斯。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般10-15mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-50d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体45-50kg。孢子粉和子实体产量比为17％-21％。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-15％。
对比例3
一种灵芝的栽培方法，与对比例2的区别仅在于：所述灵芝为紫芝ganodermasinensej.d.zhao,l.w.hsuetx.q.zhang。母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般10-15mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-50d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体45-50kg。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-15％。
对比例4
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：母种培养基采用pda培养基，包括以下成分：马铃薯200g/l、葡萄糖20g/l、琼脂粉15g/l；原种培养基包括以下重量份的成分：木屑80份、玉米芯6份、麦麸18份、石膏粉1份；搅拌均匀后加水，最终培养基含水量为55-60％；所述母种培养、原种培养均为22℃-25℃恒温暗室避光培养。所述栽培种培养基与代料栽培培养基相同，包括以下重量份的成分：棉籽壳43份、杂木屑42份、麦麸10份、豆饼粉3份、过磷酸钙1份、石膏1份。所述代料栽培条件包括：培养温度为26-28℃，空气相对湿度为60-95％，前20d光照强度1000-1500勒克斯，后期光照强度1500-3000勒克斯。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般10-15mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-50d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体45-50kg。孢子粉和子实体产量比为20％-26％。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-12％。
对比例5
一种灵芝的栽培方法，与对比例4的区别仅在于：所述灵芝为薄盖灵芝ganodermacapense(lloyd)d.a.reid。母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般10-15mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-50d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体45-50kg。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-12％。
对比例6
一种灵芝的栽培方法，与实施例1的区别仅在于：所述栽培种培养基及代料培养基的原料不包括蜜环菌发酵液和枯草芽孢杆菌发酵液。
母种、原种、栽培种、栽培袋菌丝日均生长速度一般13-16mm/d。从原基到子实体成熟一般需40-45d，一般培养后2-2.5个月可以采收；以1000kg干代料干重计，当年可以采收灵芝子实体50-65kg。孢子粉和子实体产量比为14％-15％。与实施例1相比，栽培袋杂菌污染率高5-10％。
分别对实施例1-5及对比例1-6灵芝子实体进行检测，结果如下表。检测方法分别参考“张志军等，灵芝多糖含量的苯酚硫酸法检测研究，食品工业科技,2006(2):193-195”；“李保明等，灵芝总三萜酸含量测定方法的研究，中国中药杂志，2006(12):1234-1236”。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。