一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用的制作方法

本发明属于植物保护领域，具体为一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用。

背景技术：

生物入侵指的是非土著物种到达一个新地区后，保持存活、繁殖，之后形成一定规模的种群，该种群的持续扩散将会对本地环境、经济造成明显的影响，导致生物入侵的物种被称为外来入侵物种(invasivealienspecies,简称为ias)。入侵物种会直接或间接地降低所在地区的物种多样性,它的影响仅弱于物种生境的丧失，它可使不同区域生态系统的构成、功能趋于均匀化,并最终退化，失去稳定的生态系统功能。近年来，由于入侵生物给地区生态、环境、经济带来重大影响，已成为各国研究重点，其中，美国、英国、日本等发达国家已开展大量研究。在我国，随着经济快速发展、贸易往来频繁，生物入侵也日益成为突出问题。比如，在上海，外来植物区系的比例高达57％，其中，上世纪入侵上海的喜旱莲子草(alternantheraphiloxe-roides)和加拿大一枝黄花(solidagocanadensis)，已成为分布最广的草本植物,有占领上海植物生境的趋势。

刺苍耳(xanthiumspinosuml.)为菊科(asteraceae)苍耳属的一年生草本植物，期8-9月，果期9-10月，种子繁殖，常生于路边、荒地和旱作物地，果实具钩刺，常随人和动物传播，或混在作物种子中散布。刺苍耳入侵能力强，适应范围广，易对入侵地生态环境产生严重的危害，其原产地为南美洲，现为一种分布较广的世界性入侵植物，已进入我国外来入侵物种名单(第3批)，是新疆分布面积较大的一种入侵植物。在新疆，伊犁地区为刺苍耳最早的扩散中心，现已向石河子、昌吉、乌鲁木齐等地扩散，分布区海拔在597m-1834m之间，生境类型包括荒漠草原和绿洲，刺苍耳易于散布，加之其较强的环境适应性，极易在扩散地区形成单优群落，对农牧业、林业产生严重影响和危害。

目前防控刺苍耳的主要手段有机械铲除、化学防除。机械铲除只能在较短时间、较小范围起作用，且费时费力；化学防除不具备良好的专性选择性，会对其他植物造成杀灭，而且也有可能对生境中的动物造成伤害，另外，由于自然界中缺乏将其分解的微生物，会对环境造成污染；而真菌除草剂因其来源于自然，可被微生物降解，对环境较为友好，适应可持续发展的需求。因此，开展生物防治是目前防治刺苍耳最具潜力和开发前景的方法。

技术实现要素：

本发明目的在于，提供一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，该致病菌株分类命名为层生镰刀菌(fusariumproliferatum)，是从新疆昌吉市郊外农田附近中的刺苍耳自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的真菌层生镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素，再将制备的病原菌菌丝和粗毒素喷洒在刺苍耳植株上，对恶性入侵植物刺苍耳具有很强的防治效果。本发明培养操作简单、培养基质材料易获得、所得到的病原菌菌丝和粗毒素稳定性强，获取工艺简单，可大批量生产，生产周期短，易于推广应用；以其在茎叶喷洒，使用方便，可有效杀灭目标入侵植物刺苍耳，具有较高的环境安全性。

本发明所述的一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，该真菌层生镰刀菌是从新疆昌吉市郊外农田附近中的刺苍耳自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的层生镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素，再将制备的病原菌菌丝和粗毒素均匀喷洒在入侵植物刺苍耳上，其中：

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5-1:10溶解，按20-100g/亩喷洒到刺苍耳上，1-5天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂；

或将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水以体积比1:10-1:100溶解，按20-100g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳上，1-4天后植株出现明显的死亡症状。

所述一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5溶解，按60g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳叶面上，3天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

所述一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳植株上，4天后植株出现明显的死亡症状。

所述一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，病原菌菌丝的野外实施量为20-100g/亩，粗毒素的野外实施量为20-100g/亩。

本发明所述的一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，该真菌层生镰刀菌是从新疆昌吉市郊外农田附近中的刺苍耳自然发病植株叶片上分离纯化获得的，采集时间为2017年9月。

本发明所述的一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为层生镰刀菌。

本发明所述的一种层生镰刀菌在防控入侵植物刺苍耳中的应用，其中层生镰刀菌的分离鉴定为：

刺苍耳强致病菌株的分离纯化：在新疆昌吉市郊外农田附近中的刺苍耳自然发病植株，通过孟加拉红培养基和马铃薯蔗糖培养基(pda)分离纯化得到多种真菌，并用柯赫氏法则验证，经过致病性试验的比较筛选，获得了这株对刺苍耳有很强致病作用的除草病原真菌层生镰刀菌,其所对应的rdnaits基因片段，已上传至在genbank，登录号为mg543736，名称为层生镰刀菌；

菌株的致病性：把经灭菌的滤纸放入培养皿中，每皿一张，并加入2ml灭菌蒸馏水。剪取生长健壮无病斑的刺苍耳叶片，用清水冲洗干净后，用浓度70％酒精擦洗1遍，然后再用灭菌蒸馏水漂洗3次，叶片正面向上展开放入培养皿中，每皿放1片，在叶片近边缘约1cm处针刺造成微伤口，切取在pda上培养的大小约为0.5×0.5cm²的菌块，置于伤口处，用保鲜膜密封保湿，重复3次，另做空白对照，恒温培养箱25℃保存3天，3天后叶片出现与原发病叶片一致的明显病斑；

菌株的形态特征鉴定：在pda培养基上，温度25℃培养1周，菌落呈圆形，具松散的絮状菌丝，白色,见图1-a。菌丝有隔膜，单细胞具1至多个细胞核，具产孢细胞、厚垣孢子；小分生孢子椭圆状，褐色，大多不分隔，部分为1-3个分隔，见图1-b。

菌株的分子鉴定：提取菌株的基因组dna，采用rdnaits通用引物：its1(5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3)和its4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3)进行rdnaits序列的pcr扩增，获得长度为501bp(rdnaits)基因片段，从ncbiblast检索与目标序列同源性高的dna序列，与本试验所测序列进行种内比对，由比对结果确定真菌与层生镰刀菌(fusariumproliferatum)是同一个种；

菌株的最佳培养条件和接种侵染条件：该真菌菌落生长的最适培养基为马铃薯葡蔔糖琼脂(pda)，合适温度为25-28℃，合适酸碱度为ph6-7，在这些条件下，菌落生长快；病菌侵染致病时，接种后保湿和暗光5天，并在整个侵染时期保持温度25-28℃。

层生镰刀菌菌丝的野外喷施：层生镰刀菌在水稻培养基中结束培养后，将水稻和菌体进行机械粉碎，按60g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳叶面上，粉剂与水的质量比为1:5，3天后叶片出现明显的病斑，见图2-a；

层生镰刀菌粗毒素的野外喷施：将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳植株上，4天后植株出现明显的死亡症状，见图2-b。

层生镰刀菌菌株生物防治物质的制备和应用：

菌株菌丝的制备和应用：

首先将该菌接种至2个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器中培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天。结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，粉剂与水的比例为1:5-1:10，按20-100g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳上，1-5天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂；

粗毒素的制备和应用：

用灭菌竹签挑取已纯化层生镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:10-1:100溶解，按20-100g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳上，1-4天后植株出现明显的死亡症状；

层生镰刀菌菌丝、粗毒素制剂的应用及其优点：将所得病原菌菌丝按20-100g/亩，粗毒素按20-100g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳上，对刺苍耳有良好的防除作用，且对人、畜安全，没有毒害。

附图说明

图1为本发明层生镰刀菌的形态特征：a为菌落图片，b为菌体图片；

图2为本发明刺苍耳的发病情况：a为菌丝喷洒3天后的情况，b为粗毒素喷洒4天后的情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

该真菌层生镰刀菌(fusariumproliferatum)是从新疆昌吉市郊外农田附近中的刺苍耳自然发病植株叶片上分离纯化而获得的，从分离纯化得到的层生镰刀菌中采用常规方法制备病原菌菌丝和粗毒素。

实施例1

层生镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至2个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器中培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天。结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到层生镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:10溶解，按20g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳叶面上，5天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

实施例2

层生镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至2个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器中培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到层生镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:5溶解，按60g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳叶面上，3天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂，见图2-a。

实施例3

层生镰刀菌菌丝的制备方法：

首先将该菌接种至2个装有已灭菌的400mlpdb培养基的1000ml锥形瓶内，在160rpm，温度28℃的恒温培养振荡器中培养，以形成菌液，3天后将形成可见菌块的种子液接种于60个1000ml锥形瓶的水稻培养基中进行放大培养，每瓶含200g大米，200ml蒸馏水，温度121℃灭菌30min，每瓶接10ml种子液，室温条件静置培养10天，结束后，将水稻和菌体进行机械粉碎，得到层生镰刀菌菌丝；

将制备的病原菌菌丝与水的质量比1:8溶解，按100g/亩喷洒到入侵植物刺苍耳叶面上，1天后叶片出现明显的病斑，随后病情加重，叶片腐烂。

实施例4

层生镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化层生镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:100溶解，按20g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳植株上，4天后植株出现明显的死亡症状。

实施例5

层生镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化层生镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:50溶解，按60g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳植株上，2天后植株出现明显的死亡症状，见图2-b。

实施例6

层生镰刀菌粗毒素的制备方法：

用灭菌竹签挑取已纯化层生镰刀菌菌落边缘的菌丝，接种到pdb培养基中，摇床培养7天后，对产物进行过滤，从而将菌丝体和发酵液分离，经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素；

将制备的粗毒素与吐温20以质量比1:2溶解，再将混合溶液与水的体积比1:10溶解，按100g/亩喷洒在入侵植物刺苍耳植株上，1天后植株出现明显的死亡症状。