一种金龟子绿僵菌与呋虫胺的复配杀虫剂及其应用的制作方法

本发明属于生物
技术领域：
，更具体地，涉及一种金龟子绿僵菌(metarhiziumanisopliae)与呋虫胺的复配杀虫剂及其应用。
背景技术：
：稻飞虱和稻叶蝉均是水稻上的重要迁飞性害虫，每年在我国南方与中部的水稻种植区之间往返迁飞，其若虫和成虫群集在水稻的茎杆等部位刺吸取食水稻汁液为害，同时还传播水稻矮缩病等病毒病，为害严重时可引起水稻枯黄、倒伏，最终导致水稻大面积减产、甚至绝收。呋虫胺(dinotefuran)是一种新型超级烟碱类杀虫剂，具有触杀、胃毒、速效等特点，持效期长、杀虫谱广。呋虫胺可被迅速传导到植物各部位，对蚜虫、叶蝉、飞虱、蓟马、粉虱等刺吸式口器害虫具有良好的防治效果，对哺乳动物毒性低。近年来，呋虫胺等农药在水稻上的广泛、大量使用，导致稻飞虱和稻叶蝉等水稻害虫产生了高水平的抗药性，农产品中的化学农药残留严重，同时杀死了害虫的天敌、破坏了稻田生态系统。绿僵菌是重要的昆虫病原真菌之一，具有不同于现有化学杀虫剂的全新作用机理，以及对环境无污染、无残留的优点，常用于防治稻飞虱、水稻螟虫和小菜蛾等害虫。但是，田间应用实践表明，绿僵菌等活体微生物杀虫剂的防治效果不稳定，易受南方地区的强紫外线、高温等田间环境条件的影响。因此，解决稻飞虱和稻叶蝉等水稻害虫的抗药性问题，对于高效防治水稻害虫、提高水稻的产量和品质具有重要意义。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的不足，提供一种金龟子绿僵菌与呋虫胺的复配杀虫剂及其应用。本发明的目的是提供一种复配杀虫剂。本发明的另一目的是提供所述复配杀虫剂在防治稻飞虱/稻叶蝉或制备防治稻飞虱/稻叶蝉的生物制剂中的应用。本发明的又一目的是提供一种防治稻飞虱/稻叶蝉的生物制剂。本发明上述目的通过以下技术方案实现：本发明首先提供了一种复配杀虫剂，所述复配杀虫剂中含有金龟子绿僵菌和呋虫胺。优选地，所述金龟子绿僵菌和呋虫胺的质量比为100:6.67～26.67。更优选地，所述金龟子绿僵菌和呋虫胺的质量比为100:12～16。更进一步优选地，所述金龟子绿僵菌和呋虫胺的质量比为100:16。优选地，所述金龟子绿僵菌为金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1，该诱变菌株已于2016年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为cctccno：m2016250，保藏地址为中国武汉，武汉大学。优选地，所述金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1为金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的孢子粉。本发明提供的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺有较好的生物相容性，亚剂量的呋虫胺与金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1复配得到的复配杀虫剂，对稻飞虱和稻叶蝉有显著的防治效果，能够提高真菌杀虫剂的速效性、减少化学农药的用量、降低农产品中的化学农药残留；同时，抗紫外线、耐高温的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1对稻飞虱和稻叶蝉等水稻害虫的防治效果稳定，不受南方地区的高温和强紫外线等田间环境条件的影响，对生态环境无污染，能够持续控制水稻害虫为害；因此，以下应在本发明的保护范围之内：所述复配杀虫剂在防治稻飞虱/稻叶蝉或制备防治稻飞虱/稻叶蝉的生物制剂中的应用。另外，本发明还提供了一种防治稻飞虱/稻叶蝉的生物制剂，所述生物制剂由主剂和辅剂组成；所述主剂包括金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺，所述辅剂包括稳定剂、助剂和填料。优选地，按质量百分比计，所述生物制剂包括：主剂38％～64％，稳定剂0.3％～0.8％，助剂12％～16％，填料19.2％～47.5％。优选地，所述稳定剂为纳米氢氧化铝或抗坏血酸。优选地，所述助剂为吐温-80、morwetef-w、羧甲基纤维素钠、润湿剂lx、达润助悬剂dk8、木质素磺酸钠、司班-20或op-10中的任意一种或几种。优选地，所述填料为硅藻土、凹凸棒土或石蜡油中的任意一种或几种。优选地，所述生物制剂的剂型为可湿性粉剂或油剂。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种金龟子绿僵菌与呋虫胺的复配杀虫剂及其应用。该复配杀虫剂以金龟子绿僵菌和呋虫胺为有效成分，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的相容性好，低浓度的呋虫胺与金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1复配具有协同增效的作用，显著提高了对稻飞虱和稻叶蝉等水稻害虫的杀虫效果，减少了化学农药呋虫胺的用量，可改善水稻害虫对化学农药呋虫胺的抗药性、减缓稻飞虱和稻叶蝉等水稻害虫对现有化学农药抗药性增长的速度、降低化学农药的残留；且该复配杀虫剂对水稻害虫的防治效果稳定，不受南方地区的高温和强紫外线等田间环境因素的影响，有利于保护害虫的天敌，持续地控制水稻害虫的为害，促进水稻产量和品质的提高，对环境无污染，具有良好的应用前景。附图说明图1是白背飞虱被金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1侵染后的症状图。图2是金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的抗紫外线性能测试结果图。图3是金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的耐高温性能测试结果图。具体实施方式以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的获取及对稻飞虱的侵染发明人团队在西藏地区采集到被自然侵染的金龟子(phylloperthahorticolal.)幼虫虫尸，从虫尸上经分离、筛选后获得金龟子绿僵菌野生菌株。在后期的田间应用中发现该菌株对害虫的防效不稳定，容易受南方地区的强紫外线和高温等田间环境条件的影响；为此，我们用紫外线照射野生菌诱导其产生变异，经筛选与纯化最后获得抗紫外线、耐高温的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1，并于2016年5月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2016250，保藏地址为中国武汉，武汉大学。白背飞虱被金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1侵染后的症状图如图1所示，可以看出，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1可有效地侵染白背飞虱，并引起白背飞虱(图1中的a图)的大量死亡，侵染后的第3-5天在白背飞虱的虫体上可见白色的菌丝(图1中的b图)，侵染后的第8-10天在白背飞虱的虫体上可见墨绿色的孢子粉(图1中的c图)。实施例2金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1对呋虫胺的相容性测定1、实验方法将金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1接种到查氏培养基(蔗糖30.0g、硝酸钠(nano3)3.0g、磷酸氢二钾(k2hpo4)1.0g、硫酸镁(mgso4.7h2o)0.5g、氯化钾(kcl)0.5g、硫酸亚铁(feso4)0.01g、琼脂粉20g加入水使总体积为1000ml)平板上，于26±1℃的恒温箱(l:d＝14:10)中培养至产孢后，用0.1％吐温-80无菌水收集孢子，将真菌孢子和呋虫胺在查氏培养液中混合，配制成含不同浓度呋虫胺(0.1x、0.5x、1.0x，其中1.0x表示1.0倍常规使用浓度)和真菌孢子的悬浮液，用载玻片萌发法试验；将以上含不同浓度呋虫胺和真菌孢子的悬浮液滴在无菌载玻片上，置于底部铺有滤纸的培养皿内，加无菌水保湿(100，rh)，培养21h、24h、27h后镜检，计算孢子萌发率(孢子萌发率％＝萌发的孢子数/总孢子数×100％)。每个处理3次重复。上述所有试验数据均在数据处理软件sas系统上处理完成。2、实验结果金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1在不同浓度呋虫胺溶液中的孢子萌发率结果如表1所示，可以看出，与对照组相比，在21h，1.0x和0.5x倍常规浓度呋虫胺溶液中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子萌发率均显著降低，而0.1x倍常规浓度的呋虫胺不影响金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的孢子萌发；在27h后，不同浓度呋虫胺溶液中的孢子萌发率与对照组均无显著差异，孢子萌发率均可达到86.5％以上。以上结果说明：在21h以内，1.0x和0.5x倍常规浓度的呋虫胺对金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的孢子萌发率有一定的抑制作用，在24h以后0.5x和0.1x倍常规浓度的呋虫胺对诱变菌株mauv-1的孢子萌发率无抑制作用，在27h以后呋虫胺对真菌孢子萌发的无抑制作用，说明呋虫胺对真菌孢子萌发只是短暂的抑制作用，随着时间的延长，这种抑制作用逐渐消失。以上结果表明金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺相容性好。表1金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1在不同浓度呋虫胺溶液中的孢子萌发率结果时间对照区呋虫胺(1.0x)呋虫胺(0.5x)呋虫胺(0.1x)21h58.1±2.9a42.9±3.6c50.7±2.8b57.6±4.1a24h83.4±3.3a61.3±4.1b80.5±3.7a82.4±3.5a27h90.6±4.6a86.5±4.6a87.9±5.3a89.6±5.2a注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(dmrt法)；呋虫胺(1x)、呋虫胺(0.5x)、呋虫胺(0.1x)分别表示呋虫胺的使用剂量为田间常规使用剂量、0.5和0.1倍的田间常规使用剂量。实施例3金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的耐高温和抗紫外线性能测试1、实验方法将金龟子绿僵菌野生菌株(wt)和诱变菌株(mauv-1)的分生孢子分别接种到pda平板中培养至产孢后备用，分别用0.1％吐温-80无菌水收集所有菌株的孢子配制成1.0×106孢子/ml的孢子悬浮液，并放置于紫外线下照射0、40min，然后取5ml孢子悬浮液加入装有200ml查氏培养液的三角瓶中，在26±1℃、200rpm条件下培养，在第22h、25h、28h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准。所有处理3次重复。通过比较第22h、25h、28h各菌株在孢子萌发率方面的差异，明确金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的抗紫外线性能。另外，分别用0.1％吐温-80无菌水收集所有菌株的孢子并配制成1.0×106孢子/ml的孢子悬浮液，然后取5ml孢子悬浮液加入装有200ml查氏培养液的三角瓶中，在28±1℃、34±1℃、35±1℃、37±1℃、38±1℃、200rpm条件下培养，在第25h、28h时观察并记录孢子萌发情况，以芽管长度超过孢子直径一半作为萌发标准。所有处理3次重复。通过比较第25h、28h各菌株在不同温度下孢子萌发率方面的差异，明确金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的耐高温性能。2、实验结果金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的抗紫外线性能测试结果如图2所示，从图中可以看出，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1经紫外线照射40min后，在22h、25h、28h的孢子萌发率与对照组(紫外线照射0min)差异不显著，而野生菌株经紫外线照射40min后，其孢子萌发率与对照组差异显著，经紫外线处理后野生菌株的孢子萌发率显著降低。金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的耐高温性能测试结果如图3所示，可以看出，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1在37℃高温条件下的孢子萌发率超过30％，而野生菌株在35℃条件下孢子不萌发。以上结果说明：金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1具有很好的抗紫外线性能，且在37℃高温下孢子可萌发，具有很好的耐高温性能。实施例450％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂一种金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂，具体的配方组分含量为：50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，8％呋虫胺(市购原药)，0.8％纳米氢氧化铝，5％吐温-80，4％morwetef-w，5％羧甲基纤维素钠，硅藻棒土补至100％，制得50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂；其中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的质量比为100:8。实施例530％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂一种金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂，具体的配方组分含量为：30％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，8％呋虫胺(市购原药)，0.5％纳米氢氧化铝，3％吐温-80，5％morwetef-w，6％羧甲基纤维素钠，硅藻土补至100％，制得30％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂；其中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的质量比为100:26.67。实施例660％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂一种金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂，具体的配方组分含量为：60％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，4％呋虫胺(市购原药)，0.8％纳米氢氧化铝，6％吐温-80，5％morwetef-w，5％羧甲基纤维素钠，硅藻土补至100％，制得60％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂；其中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的质量比为100:6.67。实施例750％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂一种金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂，具体的配方组分含量为：50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，6％呋虫胺(市购原药)，0.3％抗坏血酸，3％润湿剂lx，6％达润助悬剂dk8，5％木质素磺酸钠，凹凸棒土补至100％，制得50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的可湿性粉剂；其中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的质量比为100:12。实施例850％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的油剂一种金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的油剂，具体的配方组分含量为：50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，6％呋虫胺(市购原药)，0.8％纳米氢氧化铝，4％司班-20，3％吐温-80，5％op-10，石蜡油补至100％，制得50％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的油剂；其中，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的质量比为100:12。对比例1复配剂中金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺一种可湿性粉剂，除了无金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺外，其余的配方组分含量与实施例4基本相同；0.8％纳米氢氧化铝，5％吐温-80，4％morwetef-w，5％羧甲基纤维素钠，硅藻棒土补至100％，制得可湿性粉剂(金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的使用浓度为0)。对比例2复配剂中缺少呋虫胺一种可湿性粉剂，除了无呋虫胺外，其余的配方组分含量与实施例4基本相同；具体的配方组分含量为：60％金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1孢子粉(1011孢子/g)，0.8％纳米氢氧化铝，5％吐温-80，4％morwetef-w，5％羧甲基纤维素钠，硅藻棒土补至100％，制得可湿性粉剂(金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1的使用浓度为3x107孢子/ml)。对比例3复配剂中缺少金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1一种可湿性粉剂，除了无金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1外，其余的配方组分含量与实施例4基本相同；具体的配方组分含量为：8％呋虫胺(市购原药)，0.8％纳米氢氧化铝，5％吐温-80，4％morwetef-w，5％羧甲基纤维素钠，硅藻棒土补至100％，制得可湿性粉剂(呋虫胺的实际使用浓度为40μg/ml)。对比例420％呋虫胺，田间常规使用剂量(3.0g/亩/45kg水，呋虫胺的实际使用浓度为133.3μg/ml)。应用例1复配杀虫剂对白背飞虱的毒力测定利用本发明实施例4～8制备得到的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的复配杀虫剂和对比例1～4制备得到的可湿性粉剂进行毒力测定实验，测定其对白背飞虱的毒力；具体的实验方法和实验结果如下：1、实验方法供试植物为水稻(oryzasatival.)，将盆栽苗(盆直径30cm，苗高40cm，3丛/盆，6～13株/丛)放入养虫笼中，接入白背飞虱成虫待其产卵后将其全部赶出，待白背飞虱发育至4龄若虫备用，所有试验在网室中进行(32℃～37℃)；将实施例4～8制备得到的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的复配杀虫剂和对比例1～3制备得到的可湿性粉剂稀释2000倍，分别获得不同的浓度的混合液；将对比例4中的呋虫胺配制成田间常规使用浓度(133.3μg/ml)的药液，然后采用喷雾法分别将上述药液喷到不同处理组的水稻叶片和茎上，以水稻上沾满药液雾滴而不滴下为好，每个处理6盆苗，调查药后5、10天的效果，计算白背飞虱的校正死亡率，整个实验4次重复。根据如下公式计算校正死亡率：校正死亡率(％)＝(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)×100。2、实验结果本发明制备得到的复配杀虫剂对白背飞虱的毒力测定结果如表2所示，从表中可以看出，当可湿性粉剂中无金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺时(对比例1)，白背飞虱的防治效果仅为9.4％(5天)和11.7％(10天)；可湿性粉剂中只含有呋虫胺时，白背飞虱的防治效果分别为42.6％(对比例3，呋虫胺40ppm的处理区，10天)和78.6％(对比例4，呋虫胺133.3ppm的处理区，10天)；可湿性粉剂中只含有金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1时(对比例2)，白背飞虱的防治效果为35.1％(5天)和80.9％(10天)；而金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺的复配杀虫剂(实施例4～8)，对白背飞虱的防治效果为81.6％～88.6％(5天)和91.0％～97.0％(10天)；复配剂对白背飞虱的防治效果显著高于对比例1～3制备得到的可湿性粉剂对白背飞虱的防治效果，显著高于对比例4呋虫胺的常规田间推荐使用浓度的防治效果。另外，复配杀虫剂对白背飞虱的防治效果显著高于单剂的防治效果，与真菌杀虫剂相比在提高防治效果的同时缩短了杀虫时间，与化学农药相比在提高防治效果的同时延长了防治持效时间。其中，与金龟子绿僵菌单剂(金龟子绿僵菌mauv-1的使用浓度为3x107孢子/ml)相比，复配杀虫剂对呋虫胺的效果提高了132.5％-152.4％(第5天)和12.5％-19.9％(第10天)，说明爪哇棒束孢真菌杀虫剂中加入呋虫胺后提高了杀虫的速效性，第5天的防治效果显著提高了1.3倍以上。与化学农药呋虫胺单剂(呋虫胺的使用浓度为40μg/ml)相比，复配杀虫剂对白背飞虱的防治效果提高了100％-117.2％(第5天)和113.6％-127.7％(第10天)，说明化学农药中加入真菌杀虫剂后在防治效果提高1倍以上的同时也延长了药物的有效防治时间。复配杀虫剂与常规使用剂量的化学农药相比，在提高防治效果的同时减少了化学农药的使用量233.3％。以上结果说明，本发明制备得到的金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1与呋虫胺的复配杀虫剂对白背飞虱具有显著的防治效果，金龟子绿僵菌诱变菌株mauv-1和呋虫胺复配能够起到协同增效的作用，复配杀虫剂对白背飞虱的防治效果显著高于单剂的防治效果，在提高防治效果的同时缩短了杀虫时间、延长了防治持效时间、减少了化学农药的使用量。表2本发明制备得到的复配杀虫剂对白背飞虱的毒力测定结果(复配剂稀释2000倍)注：表中同列数字后字母相同表示差异不显著(dmrt法)。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 2 3