一种山奈脱毒苗的繁育方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种山奈脱毒苗的繁育方法。

背景技术：

山奈(kaempferiagalangal.)，别名沙姜、山辣等，属姜科山奈属多年生宿根草本；其性耐旱耐瘠怕浸，分布和栽培于广东、广西、云南、台湾等省区。山奈供药用或食用的部位为地下块状茎，单生或数枚连接，淡绿色或绿白色，芳香；山奈既是著名的中药，又是食用调味品并具有独特风味，也是食品加工香料、酱油等的原材料，在市场上深受欢迎。

山奈在常规栽培中，采用块状茎作为种植材料；收获时选用当年生、健壮、无病虫害及未受冻害的根茎，沙藏越冬做种苗；这样不仅消耗大量的商品山奈，而且需要大量的土地留种，生产成本较高，而且存在病虫害严重等问题。尤其是病毒病引起的灾害，在当前尚未有特效药进行防治。例如，最常见的病害沙姜瘟，其危害程度可达田块病株率为30％-50％，甚至高达80％以上，而且成片发生。因此，如能利用组织培养技术进行山奈脱毒培养获得快速繁殖无病毒种苗，可为较低成本地实现工厂化生产脱毒苗提供新途径。

技术实现要素：

本发明的目的是针对常规留种育苗病株率高的缺陷，提供一种山奈脱毒苗的繁育方法。

本发明的山奈脱毒苗的繁育方法，包括以下步骤：

a.外植体准备：

取当年生的山奈地下块茎，清理干净表面后晾干，将芽切下至直径为0.5-1.0cm大小，去掉表皮和叶鞘，完成外植体准备；

b.无菌芽获得：

将外植体消毒处理后接种到初代培养基中，培养获得无菌芽；所述的初代培养基：每升含有6-ba1.0mg、naa0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8；

c.无菌芽的继代壮芽：

将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中，培养长成无菌苗，所述的继代培养基：每升含有6-ba2.0mg、naa0.1-0.5mg、特美汀250-500mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8；

d.无菌苗增殖及生根：

将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中，培养获得生根苗；

e.生根苗炼苗及移栽：

将长至6-8cm高的生根苗炼苗，然后移栽。

优选，所述的增殖培养基：每升含有6-ba3.0mg、tdz0.75mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。

优选，所述的增殖培养基：每升含有6-ba2.0mg、tdz0.75mg、naa0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。

优选，所述的增殖培养基：每升含有tdz0.25mg、naa0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。

优选，所述的步骤b中的外植体消毒处理是将外植体用无菌水冲洗两次，然后用体积分数70％-75％乙醇水溶液消毒40-60s，无菌水冲洗1次，用质量分数0.1％-0.2％hgcl2溶液加终浓度为质量分数0.02％的吐温-20消毒5-6min，无菌水冲洗1次，再用质量分数0.1％-0.2％hgcl2溶液消毒6-7min，无菌水彻底冲洗干净，然后吸去表面的水分。

优选，所述的步骤b、c和d中的培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度50％-80％，光照强度为1400-2000lx，光照时间为12h/d。

优选，所述的步骤e的生根苗炼苗，是将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2-3d，全开盖培养3-4d完成炼苗。

优选，所述的步骤e的移栽，是将炼苗后的生根苗取出，洗干净根部培养基，移栽到泥炭基质中，移栽后的10-15d内，每隔2-3d喷质量分数0.1％-0.3％的百菌清溶液消毒，待在泥炭基质中生长30-40d后再移栽到大田里。

本发明相对于现有技术具有以下优点和特点：

(1)外植体准备操作过程，如何选择芽及去除叶鞘组织是关键。用解剖刀轻轻刮掉芽的表皮及其周围的褐色组织，尤其是靠近芽的基部的部位，小心不要伤到幼嫩的芽。

(2)本发明通过在外植体初代培养、继代壮芽培养过程中结合使用抗生素特美汀，能保证高质量的获得山奈无菌苗。

(3)利用本发明的增殖培养基，同时进行无菌苗的增殖和生根，缩短培养时间及节约成本。

(4)利用本发明方法获得的无菌生根苗移栽后的成活100％，分蘖能力强；而常规留种育苗第二年种植死亡率达到80％(图10、11)。

采用本发明所述的方法得到的芽增值系数为3.27-5.2，获得组培苗的生根率为100％，移栽的成活率为100％且无病虫害的感染，有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。

附图说明

图1是实施例1经初代培养基培养获得的无菌芽；

图2是实施例1在继代培养基中培养壮芽；

图3是实施例1增殖及生根培养获得的生根苗；

图4是实施例1获得的生根苗的根的生长情况；

图5是组培苗移栽大田生长三个月后的长势；

图6是组培苗移栽大田生长三个月后的单株山奈长势；

图7是实施例2增殖及生根培养获得的生根苗；

图8是实施例2获得的生根苗的根的生长情况；

图9是实施例3增殖及生根培养获得的生根苗；

图10是常规留种育苗大田生长情况；

图11是常规留种育苗单株山奈大田生长情况。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法，包括以下步骤：

(1)外植体准备：取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎，剪掉块茎上的根，用流水将其表面的泥土冲掉，用毛刷轻轻刷干净表面，晾干，将芽切下至直径约1.0cm大小，用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织，尤其是靠近芽的基部的部位，小心不要伤到幼嫩的芽，直至完全剥掉表皮和叶鞘，完成外植体准备；然后放入无菌水中备用。

(2)无菌芽获得：将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次，然后用体积分数75％乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃，使其消毒充分；下同)60s，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％hgcl2溶液加终浓度为质量分数0.02％的吐温-20消毒5min，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％hgcl2溶液消毒7min，无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后，用消毒滤纸吸去外植体表面的水分，接种到初代培养基中，培养获得无菌芽(如图1所示)；所用的初代培养基：每升含有6-ba1.0mg、naa0.5mg、特美汀500mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；初代培养获得无菌芽的成功率为74.04％。

(3)无菌芽的继代壮芽：将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养，生长壮芽(如图2所示)至长成无菌苗，所用的继代培养基：每升含有6-ba2.0mg、naa0.5mg、特美汀500mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次，后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d。

(4)无菌苗增殖及生根：将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养，增殖培养时同时生根，获得生根苗；所用的增殖培养基：每升含有6-ba3.0mg、tdz0.75mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；增殖倍数为5.2，获得生根苗如图3所示，生根情况如图4所示。

(5)生根苗炼苗：将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2d，全开盖培养4d完成炼苗。

(6)移栽：将炼苗成功的山奈生根苗取出，洗干净根部培养基，小心不要伤到根，移栽到泥炭基质中，移栽后的15d内，每隔3d要喷质量分数0.3％的百菌清溶液消毒，待在泥炭基质中生长40d后再移栽到大田里。生长三个月后，组培苗长势旺盛，叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象(如图5、6所示)。

采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为5.2，获得组培苗的生根率为100％，移栽的成活率为100％，分蘖能力强，且无病虫害的感染，有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。

实施例2

本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法，包括以下步骤：

(1)外植体准备：取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎，剪掉块茎上的根，用流水将其表面的泥土冲掉，用毛刷轻轻刷干净表面，晾干，将芽切下至直径约1.0cm大小，用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织，尤其是靠近芽的基部的部位，小心不要伤到幼嫩的芽，直至完全剥掉表皮和叶鞘，完成外植体准备；然后放入无菌水中备用。

(2)无菌芽获得：将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次，然后用体积分数75％乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃，使其消毒充分；下同)60s，无菌水冲洗1次，质量分数0.2％hgcl2溶液加终浓度为质量分数0.02％的吐温-20消毒6min，无菌水冲洗1次，质量分数0.2％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后，用消毒滤纸吸去外植体表面的水分，接种到初代培养基中，培养获得无菌芽；所用的初代培养基：每升含有6-ba1.0mg、naa0.5mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；初代培养获得无菌芽的成功率为53.85％。

(3)无菌芽的继代壮芽：将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养，生长壮芽至长成无菌苗，所用的继代培养基：每升含有6-ba2.0mg、naa0.5mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次，后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d。

(4)无菌苗增殖及生根：将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养，增殖培养时同时生根，获得生根苗；所用的增殖培养基：每升含有6-ba2.0mg、tdz0.75mg、naa0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度80％，光照强度为2000lx，光照时间为12h/d；增殖倍数为5.03，获得生根苗如图7所示，生根情况如图8所示。

(5)生根苗炼苗：将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养2d，全开盖培养4d完成炼苗。

(6)移栽：将炼苗成功的山奈生根苗取出，洗干净根部培养基，小心不要伤到根，移栽到泥炭基质中，移栽后的15d内，每隔3d要喷质量分数0.3％的百菌清溶液消毒，待在泥炭基质中生长40d后再移栽到大田里。生长三个月后，组培苗长势旺盛，叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象。

采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为5.03，获得组培苗的生根率为100％，移栽的成活率为100％，分蘖能力强，且无病虫害的感染，有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。

实施例3

本实施例的山奈脱毒苗的繁育方法，包括以下步骤：

(1)外植体准备：取当年生的生长旺盛的山奈地下块茎，剪掉块茎上的根，用流水将其表面的泥土冲掉，用毛刷轻轻刷干净表面，晾干，将芽切下至直径约0.5cm大小，用解剖刀轻轻刮掉表皮及其周围的褐色组织，尤其是靠近芽的基部的部位，小心不要伤到幼嫩的芽，直至完全剥掉表皮和叶鞘，完成外植体准备；然后放入无菌水中备用。

(2)无菌芽获得：将外植体在超净工作台上用无菌水冲洗两次，然后用体积分数70％乙醇水溶液消毒(消毒过程中要保持摇晃，使其消毒充分；下同)40s，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％hgcl2溶液加终浓度为质量分数0.02％的吐温-20消毒6min，无菌水冲洗1次，质量分数0.1％hgcl2溶液消毒6min，无菌水冲洗五次以上将消毒溶液彻底冲洗干净后，用消毒滤纸吸去外植体表面的水分，接种到初代培养基中，培养获得无菌芽；所用的初代培养基：每升含有6-ba1.0mg、naa0.1mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度50％，光照强度为1400lx，光照时间为12h/d；初代培养获得无菌芽的成功率为54.55％。

(3)无菌芽的继代壮芽：将初代培养获得的山奈无菌芽转接到继代培养基中培养，生长壮芽至长成无菌苗，所用的继代培养基：每升含有6-ba2mg、naa0.1mg、特美汀250mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。该无菌芽的继代壮芽步骤可重复1-3次，后续重复的转接继代壮芽时继代培养基中可不加特美汀。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度50％，光照强度为1400lx，光照时间为12h/d。

(4)无菌苗增殖及生根：将获得的无菌苗剪去叶片和茎后转接到增殖培养基中培养，增殖培养时同时生根，获得生根苗；所用的增殖培养基：每升含有tdz0.25mg、naa0.1mg、蔗糖30g、琼脂7g，余量为ms培养基，ph5.8。培养条件：温度为25℃±2℃，相对湿度50％，光照强度为1400lx，光照时间为12h/d；增殖倍数为3.27，获得生根苗如图9所示。

(5)生根苗炼苗：将长至6-8cm高的生根苗放置在室温自然光照下半开盖培养3d，全开盖培养3d完成炼苗。

(6)移栽：将炼苗成功的山奈生根苗取出，洗干净根部培养基，小心不要伤到根，移栽到泥炭基质中，移栽后的10d内，每隔2d要喷质量分数0.1％的百菌清溶液消毒，待在泥炭基质中生长30d后再移栽到大田里。生长三个月后，组培苗长势旺盛，叶片葱绿无叶缘变黄、叶片长斑、溃烂现象。

采用本实施例的培养方法得到的芽增值系数为3.27，获得组培苗的生根率为100％，移栽的成活率为100％，分蘖能力强，且无病虫害的感染，有效的解决了山奈传统的种植方式容易受到病虫害感染的问题。