大麦籽粒60Co-γ射线辐射和EMS处理复合诱变育种方法

本发明属于农业技术领域，具体涉及一种大麦籽粒⁶⁰co-γ射线辐射和ems处理复合诱变育种方法。

背景技术：

大麦(hordeumvulgare)是全球也是我国第四大禾谷类作物，具有早熟、耐寒、耐旱、耐盐碱、耐瘠薄等特性。大麦是典型的“多元”作物，具有食用、饲用、酿造及保健品原料等多种用途。但是目前我国的大麦生产却自给率低、对外依存度高。2013年，我国约进口233.5万吨啤酒大麦(数据来源于国家海关总署)，未来我国啤酒大麦的供应问题也将成为相关企业必然面临的严峻问题。因此，培育高产专用型大麦品种，对于加快我国畜牧业产业化进程并改变啤酒大麦依赖进口的局面，从而保障我国粮食安全具有重要意义。而目前我国大麦育种中，现有亲本资源匮乏、遗传基础狭窄，严重制约了品种的遗传改良和突破性品种的培育(“张赤红和张京.大麦品种资源遗传多样性的ssr标记评价.麦类作物学报.2008年第28卷第2期”；刘志敏，金能，吕超等.大麦种质资源的ssr遗传多样性分析.麦类作物学报.2011年第31卷第5期.)。

辐射诱变育种可以提高基因交换、基因重组和打破不利基因连锁，辐射可创造丰富的遗传变异，拓宽原品种的遗传基础(“孙君灵,杜雄明,孙其信等.棉花γ射线诱变后代的ssr标记遗传多样性.中国农业科学.2006年第39卷第10期”)。我国的辐射诱变育种研究始于1957年，经过多年的努力，至2009年9月，以辐射诱变为主，与其他育种方法相结合，已累计育成新品种800余个，位居世界之首，辐射诱变技术在培育新品种和创制种质新资源方面发挥了重要作用(“斯琴图雅,高德玉,张玉宝等.我国水稻辐射诱变育种现状.黑龙江农业科学.2013年第4卷第5期”)。

技术实现要素：

为解决大麦遗传资源匮乏，遗传基础狭窄问题，培育出新品种和创制种质新资源，本发明提供如下技术方案：

本发明的一个目的是提供一种植物诱变育种的方法。

本发明提供的方法，为将植物种子经⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变，实现诱变育种。

上述方法中，所述植物种子经⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变为将所述植物种子依次经⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变。

上述方法中，所述⁶⁰co-γ射线辐射诱变采用的剂量为300-350gy；

和/或，所述⁶⁰co-γ射线辐射诱变的剂量率为1.92-26.00gy/min；

上述方法中，所述⁶⁰co-γ射线辐射诱变的时间为30-45min；

上述方法中，所述ems诱变采用体积百分含量为1％的ems水溶液进行诱变；

上述方法中，所述ems诱变的时间为7-10小时。

上述方法中，在所述ems诱变后，还包括步骤：

1)以不进行任何诱变的植物种子记作对照组种子；以依次经⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变的植物种子记作处理组种子；

播种所述处理组种子和所述对照组种子，得到的存活植株分别记作处理组存活植株和对照组存活植株；比较所述处理组存活植株和所述对照组存活植株的性状，从所述处理组存活植株中选取株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少有一个性状与所述对照组存活植株表现不同的植株，记作初选突变体m1代；

将所述处理组存活植株中株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状与所述对照组存活植株表现均相同的植株记作混选株系m1代；

2)从所述初选突变体m1代、混选株系m1代和所述对照组存活植株中收获种子种子再次播种，得到初选突变体m2代存活植株、混选株系m2代和所述对照组存活植株；

从初选突变体m2代存活植株中选取株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少一种性状与所述对照组存活植株不同的植株，记作m2代突变体，收取种子种植，选取行内性状表现纯合一致(1个单株收获的种子，种成1行，同一性状单株间是相同的)的单株，即为目标突变体；

从混选株系m2代存活植株中选取株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少一种性状与所述对照组存活植株不同的植株，记作混选株系m2代突变体，收取所述混选株系m2代突变体种子种植，再次播种后，从存活植株中选取与株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少一种性状与所述对照组存活植株不同的植株，记作混选株系m3代突变体，收取种子种植，选取行内性状表现纯合一致的单株，即为目标突变体。

上述方法中，所述植物为大麦。

和/或，所述大麦具体为地方品种、选育品种、品系或国外引进品种。

上述方法中，所述大麦的品种为鄂大麦934。

本发明的方法根据本领域公知常识可知，只要样本量大，或者重复足够多的次数，一定能重复本发明。

本发明还有一个目的是提供⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变的用途。

本发明提供了上述方法中⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变在制备大麦新种质中的应用。

本发明提供了上述方法中⁶⁰co-γ射线辐射诱变和ems诱变在提高大麦在基因水平上的突变率中的应用。

大麦从亲本选配到品种审定需要经过杂交、单株选择、鉴定试验、品系比较、国家或省区试和生产示范等过程。其中，杂交需要1-2年的时间，单株选择至后代无分离，需要3-5年的时间，鉴定和品系比较需要1-2年的时间，区试和生产试验需要2-3年的时间，因此，一个品种的形成至少需要7年的时间，而辐照诱变可以在3-4年之内完成上面3个步骤。

本发明将⁶⁰co-γ射线辐射和ems处理复合诱变大麦籽粒进行大麦育种；与单独使用⁶⁰co-γ射线辐射或ems诱变剂处理，该方法可以更大限度地提高大麦在基因水平上的突变率，创造丰富的遗传变异，拓宽麦种质资源遗传基础，缩短育种年限，最终促进大麦新种质的产生，提高大麦综合生产能力，实现农民增收、农业增效，为大麦新品种选育提供了简便、高效的方法；具体优点如下：

1、由于处理的材料为种子，一次性即可处理大批材料，本发明的方法增加了变异株的基数；处理成本低廉，且能够有效的缩短育种周期；2、本发明的方法同时采用⁶⁰co-γ射线辐射和ems复合处理方法对大麦种子进行诱变，较单独处理，可创造更为丰富的遗传变异，拓宽大麦的遗传基础；3、植物自然突变发生频率很低，通常为10^-6，本发明方法的复合处理可大幅度提高突变频率。

附图说明

图1为对照和突变植株株高情况(左侧为矮杆突变体，右侧为野生型鄂大麦934)。

图2为对照和突变植株叶片颜色情况(左侧为黄叶突变体，右侧为野生型鄂大麦934)。

图3为对照和突变植株穗子形态情况(左侧为野生型鄂大麦934，右侧为穗分枝突变体)。

图4为对照和突变植株籽粒大小情况(上排为短圆型突变体，下排为野生型鄂大麦934)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的大麦品种为饲料型大麦品种“鄂大麦934”：记载于“董静，李梅芳，葛双桃，许甫超，秦丹丹.鄂大麦934的选育及其特征特性.大麦与谷类科学.2013年第16卷第4期”一文，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。

实施例1、大麦种子⁶⁰co-γ射线辐射和ems复合诱变育种方法

一、诱变处理

1、种子的收集

大麦正常生长季节内，4月底自然成熟后进行人工收割，充分晒干后，利用脱粒机进行脱粒(注意无混杂)，然后置于阴凉、通风、干燥的场所内进行充分干燥，挑选大小均匀一致、健康无病害的饱满种子备用。

2、诱变处理

处理组：

a、辐射处理：将上述1挑选的1.5kg种子，利用剂量为300-350gy的⁶⁰co-γ射线辐照处理(剂量率为1.92-26.00gy/min)，具体采用动态辐照的方法：

将种子放置在吊具上，吊具在悬挂链带动下围绕钴源进行动态步进式运行，设定辐照剂量为300-350gy，剂量率是动态的。选择一个起始工位，共运行15个工位，每个工位停留2.6分钟，当样品运行到辐照室外操作间即可取样；辐射处理时间为39min，得到辐照处理后的种子。

上述重铬酸银剂量计实测⁶⁰co-γ射线剂量为320gy，剂量率1.92-26.00gy/min；

b、ems处理：将上述a辐照处理后的种子，室温下清水浸泡1小时后，用体积百分含量为1％ems水溶液(sigma)在摇床上震荡8小时后，自来水下冲洗3小时，除去种子胚上残留的ems，防止诱变剂对种子产生不良后果。种子冲洗后，经短时间晾干，得到处理组。

对照组：不进行任何诱变处理的种子记作对照组种子。

二、处理后的播种及其栽培管理

1、种子幼苗长势统计

从上述一得到的处理组和对照组中分别挑选100粒种子，均匀摆放在铺有湿润滤纸的培养皿中，及时补充水分，保证滤纸处于湿润状态，分别于7天和14天后统计苗高、根数和主根长，结果如下表1：

表1统计苗高、根数和主根长

上述表1可以看出处理对种子活力和幼苗生长产生了显著影响。

2、播种及其栽培管理

同年11月上旬，将上述一得到的15000粒处理组种子和720粒对照组种子分别进行点播，行长3.0m，行距25cm，株距5cm，每50行种植1行对照组种子。基肥以有机肥为主，追肥注意n、p、k的配合使用，其它栽培措施与当季大麦常规种植相同，存活的植株，记作处理组存活植株和对照组存活植株。

处理组存活植株为8432株。

对照组存活植株为648株。

3、初选突变体获得

对上述2中的8432株处理组存活植株和648株对照组存活植株每1-2周进行调查记载，比较处理组存活植株和对照组存活植株的性状，从处理组存活植株中选择在株高、株型、生育期、叶片大小(长、宽)、叶片形状(卷曲等)、叶片颜色、穗子宽度、穗子长度、分枝形态、籽粒形状、结实率等性状中至少有一个性状与对照组存活植株表现不同的植株，挂牌记作初选突变体m1代；将处理组存活植株中株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、穗子长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状与所述对照组存活植株表现均相同的植株记作混选株系m1代；

及时进行收获、脱粒、晾晒和保存，共计收获405初选突变株，其中株高差异显著的67株、株型变化显著的14株、生育期差异显著的50株、叶片大小36株、叶片形状8株、叶片颜色10株、穗子宽度12株、长度43株、分枝形态4株、籽粒形状60株、结实率下降的120株。其余单株每株收1穗混合脱粒。

图1为对照和突变植株株高情况(左侧为矮杆突变体，右侧为野生型鄂大麦934)。

图2为对照和突变植株叶片颜色情况(左侧为黄叶突变体，右侧为野生型鄂大麦934)。

图3为对照和突变植株穗子形态情况(左侧为野生型鄂大麦934，右侧为穗分枝突变体)。

图4为对照和突变植株籽粒大小情况(上排为短圆型突变体，下排为野生型鄂大麦934)。

4、目标株系筛选

1)初选突变体的加代

从上述3得到的405株初选突变体m1代单株种植，每株种植1行，称为株行，行距20cm，行长1m，株距约为5cm，其它栽培及管理措施同当季大田。混合脱粒种子按照上述2中播种方法种植。分别得到初选突变体m2代存活植株和混选株系m2代存活植株。

2)筛选

对上述初选突变体m2代存活植株和混选株系m2代存活植株每1-2周进行调查记载，

从初选突变体m2代存活植株中保留在株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率等性状中至少有一个性状与对照组表现不同的株行，从中选择典型单株进行挂牌，记作记作m2代突变体，收取种子种植，选取行内性状表现纯合一致(1个单株收获的种子，种成1行，同一性状单株间是相同的)的单株，即为目标突变体。

从混选株系m2代存活植株中选取株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少一种性状与所述对照组存活植株不同的植株，记作混选株系m2代突变体，收取混选株系m2代突变体种子种植，再次播种后，从存活植株中选取与株高、株型、生育期、叶片大小、叶片形状、叶片颜色、穗子宽度、长度、分枝形态、籽粒形状、结实率性状中至少一种性状与所述对照组存活植株不同的植株，记作混选株系m3代突变体，收取种子，再进行籽粒蛋白质含量测定，继续种植，选取行内性状表现纯合一致的单株，即为目标突变体。

共计入选982株目标突变体，用于后续研究，突变类型及比例见表2。

表2突变类型及比例

(表中第2列的株数为第一列突变对应的株数，但是一个突变体会多种突变，重复出现；也就是说第2列的株数之间有重复)

突变率＝突变植株株数/处理种子数，本发明中为982/15000＝6.5％。