利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法与流程

本发明属于油菜选育技术领域，公开了一种利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法。

背景技术：

目前，最接近的现有技术：早在19世纪后期，根肿病开始在北美洲澳洲广泛发生，直到20世纪初，根肿病几乎在所有的大洲都广泛发生，在我国大部分地区也有分布。其导致十字花科作物每年全球范围内发生10％-15％的减产，从而成为制约十字花科作物生产的主要因素之一。根肿病是一种由芸薹根肿菌引起的土传病害，是广泛栽培种植的十字花科作物的主要的毁灭性病害之一。主要危害植物根部，引起植株根部形成肿瘤，肿瘤会阻碍植株营养元素和水分的吸收，严重影响植株正常的生长，导致作物田间产量降低。植株一旦侵染根肿菌，土壤将长期带菌，不再适宜栽培十字花科作物。

目前国内主要采用传统的化学方法来防治根肿病，但不能从根本上解决油菜根肿病传播，同时也带来了环境的污染，不利于农业的可持续发展。选育抗病品种被认为是防治根肿病最为安全、经济和有效的措施。近年来，许多单位利用回交转育法转育甘蓝型油菜抗根肿病种质，但是传统的回交转育法，仅仅只靠目测、简单的表型选择，没有在分子水平进行精准鉴定，选育速度非常缓慢，而且很容易丢失抗性基因，截止目前为止，极少有抗根肿病的甘蓝型油菜种质被合成。

甘蓝型油菜在三大类型栽培油菜中种植面积最大，在油菜生产中占有重要的地位，因此开展甘蓝型油菜抗根肿病研究，培育抗根肿病的甘蓝型油菜新品系，对提高油菜抗根肿病能力具有极其重要的战略意义。十字花科根肿病存在多个生理小种，在我国，甘蓝型油菜根肿病病原至少存在2号、4号和7号等生理小种类型，其中4号小种存在的范围最广泛。由于不同的生理小种所对应的致病基因不尽相同，在某一地区抗根肿病的品种种植到另外的区域后，常常由于生理小种发生改变而导致原来的抗根肿病品种变为感根肿病的品种，这给根肿病的防治带来极大的困难。此外，由于现有的一些十字花科材料抗性比较单一，多年种植后其抗性逐渐退化，因此，急需培育聚合多个抗性基因、抗多个根肿病菌生理小种的品种。

我国并不是甘蓝型油菜的起源中心，甘蓝型油菜从欧洲传入我国仅有几百年，种质资源稀少，而且遗传背景较为狭窄，目前在我国抗根肿病的油菜品种非常少，而且抗性来源很单一，但是其近缘物种白菜、甘蓝中存在抗根肿病的材料，因此，有必要从这些物种中将根肿病的抗性基因导入到甘蓝型油菜中，育成抗多个生理小种的甘蓝型油菜新品种，从而缓解我国油菜根肿病的蔓延。

综上所述，现有技术存在的问题是：

(1)甘蓝型油菜中抗根肿病的种质资源比较稀少，难以满足甘蓝型油菜根肿病抗性育种的要求。

(2)现有的甘蓝型油菜材料中根肿病抗性来源较为单一，而且仅抗少数生理小种，出现抗性衰退的现象。

(3)传统的甘蓝型油菜根肿病抗性材料选育方法较为缓慢。

解决上述技术问题的难度：目前单靠从甘蓝型油菜筛选抗根肿病的种质，培育抗根肿病的甘蓝型油菜新品种，很显然是行不通的，因此必须从其近缘物种中挖掘抗病基因。目前大多数研究者都从白菜中寻找抗源，但是造成了抗性基因的来源较为单一，而且抗性很容易消失，因此必须拓宽抗性基因的来源渠道，十分有必要从甘蓝从获得抗性基因的，增强甘蓝型油菜抗病的持久性。

传统的回交转育方法，主要根据田间表型进行选择，工作量很大，而且很容易选择错误，缺乏分子水平的精准鉴定，见效很慢。如果将传统的回交转育法与分子标记技术相结合，将会大大提高后代个体的选择的精准度，少走弯路，加快选育进程，就目前国内大部分研究单位而讲，改种方法简单，容易操作，成本较低。

解决上述技术问题的意义：该发明提供了一条选育甘蓝型油菜抗根肿病种质的新途径，有利于拓宽甘蓝型油菜根肿病抗性来源，合成的含有多个抗性位点的种质往往具有较为持久的抗病性。该方法的广泛应用，将会大大加快甘蓝型油菜的根肿病种质的选育进程，对于缓解目前根肿病的蔓延起到较好的抑制作用。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法。

本发明是这样实现的，一种利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法，所述利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法利用远缘杂交的方法，以抗根肿病白菜品种文鼎春蕾与抗根肿病中花芥蓝为根肿病的抗性基因来源，其中白菜品种文鼎春蕾抗根肿病p4与p7生理小种，中花芥蓝抗p4以及p7生理小种，均在市场可以获得的。

以中双11为轮回亲本，以远缘杂交获得的真杂种做母本，进行回交，利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记ip13-2以及芥蓝中抗根肿病的分子标记kasp1去筛选含有白菜与芥蓝抗性的植株，利用中双11与其回交，获得bc2的种子，利用p4生理小种接种该分离群体，同时利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记ip13-2以及芥蓝中抗根肿病的分子标记kasp1筛选抗病植株。

进一步，所述分子标记ip13-2的序列为seqidno：1；所述分子标记kasp1的序列为seqidno：2。

进一步，所述利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法包括以下步骤：

第一步，以感根肿病油菜品种中双11为受体(做母本)与白菜品种文鼎春蕾做杂交，收获种子后，对f1代利用p4生理小种做抗性鉴定，同时利用细胞学、分子标记进行真假杂种鉴定，挑选抗p4生理小种的真杂种做母本，与中花芥蓝做杂交，授粉15天后，挑选种子进行胚挽救；

第二步，利用细胞学、分子标记杂交后代进行真假杂种鉴定，挑选真杂种；以中双11为轮回亲本，以远缘杂交获得的真杂种做母本，进行回交；利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记ip13-2以及芥蓝中抗根肿病的分子标记kasp1筛选抗病植株；

第三步，利用100对分布于甘蓝型油菜全基因组的ssr标记对获得的抗病植株进行背景选择，筛选与中双11遗传背景最相似的抗性个体，继续与中双11进行回交，重复bc2代的选育过程，一直到bc5，将选择获得抗性植株自交获得bc5f1，利用p4生理小种接种该群体，筛选抗病植株，同时利用分子标记ip13-2与kasp1检测该分离群体中是否存在白菜与芥蓝的抗性位点；

第四步，将获得同时具有白菜及甘蓝抗性的植株利用ssr标记背景选择，获得与中双11相似度最高的个体，连续自交3代，一直到bc5f4。对bc5f4种子分别用p4与p7生理小种进行接种鉴定，以及利用ip13-2与kasp1检测抗性位点，最终获得具有多个抗性基因、抗多个生理小种的甘蓝型油菜品系。

进一步，所述第一步胚挽救的具体方法如下：利用含2％的蔗糖的b5液体培养培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2％蔗糖的b5固体培养基上，3-4叶期时移至土壤中。

本发明的另一目的在于提供一种所述利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法在油菜育种中的应用。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：本发明利用白菜与芥蓝中的抗根肿病资源，利用聚合育种的方法培育具有多个根肿病抗性基因、抗多个根肿病生理小种的甘蓝型油菜。

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

(1)甘蓝型油菜中根肿病抗性资源缺乏，通过传统的在油菜中筛选抗性材料就显得不太现实，油菜的近缘物种白菜与甘蓝中存在抗性材料。本发明通过远缘杂交聚合白菜与甘蓝的抗性基因育成抗根肿病的甘蓝型油菜，这为甘蓝型油菜根肿病抗性种质的选育提供了一个良好的思路。

(2)聚合了多个抗根肿病的基因，提高了甘蓝型油菜对根肿病的抗性。目前世界上公布的抗性基因主要来自白菜，一般是单基因或者是主效基因，当抗性基因转入到油菜中，其抗性往往持久性不强，为了提高油菜的抗性时间，本发明将白菜与甘蓝的抗性基因同时导入到油菜中，由于这些材料均抗我国两个主要的生理小种，因此远缘杂交育成的油菜品系具有多个抗性基因，而且抗多个生理小种，延长了油菜品种的抗性时间以及扩大其适宜范围。

(3)加快了甘蓝型油菜抗根肿病材料培育的进程。远缘杂交育成新种质是一个漫长的过程，需要10多年的时间，才能形成稳定的品系，特别是在三个不同物种的聚合育种中，其后代目标性状的选择极为困难，本发明采用分子标记辅助选择的方法，加快遗传背景快速趋近轮回亲本，同时在极为复杂的后代个体中准确筛选到目标单株，会大大减少选育时间与工作量。

附图说明

图1是本发明实施例提供的利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法的实现流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法包括以下步骤：

s101：以感病的甘蓝型油菜品种中双11为受体，先以中双11做母本与白菜品种文鼎春蕾做杂交，再挑选抗p4生理小种的真杂种做母本，与中花芥蓝做杂交，利用胚挽救技术获得杂交后代；

s102：利用细胞学、分子标记杂交后代进行真假杂种鉴定，挑选真杂种；

s103：利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记ip13-2以及芥蓝中抗根肿病的分子标记kasp1筛选抗病植株；

s104：利用100对分布于甘蓝型油菜全基因组的ssr标记对获得的抗病植株进行背景选择，筛选与中双11遗传背景最相似的抗性个体，继续与中双11进行回交，重复bc2代的选育过程，一直到bc5；

s105：将获得同时具有白菜及甘蓝抗性的植株利用ssr标记背景选择，获得与中双11相似度最高的个体，连续自交，一直到bc5f4，对后代植株进行抗病性鉴定，获得聚合多个抗性基因的甘蓝型油菜品系。

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明利用远缘杂交的方法，以抗根肿病白菜品种文鼎春蕾与抗根肿病中花芥蓝为根肿病的抗性基因来源，其中白菜品种文鼎春蕾抗根肿病p4与p7生理小种，中花芥蓝抗p4以及p7生理小种。

如图2所示，本发明实施例提供的利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法具体包括以下步骤：

第一步，以感根肿病国油菜品种中双11为受体。先以中双11做母本与白菜品种文鼎春蕾做杂交，收获种子后，对f1代利用p4生理小种做抗性鉴定，同时利用细胞学、分子标记进行真假杂种鉴定，挑选抗p4生理小种的真杂种做母本，与中花芥蓝做杂交，授粉15天后，挑选种子进行胚挽救。胚挽救的具体方法如下：利用含2％的蔗糖的b5液体培养培养未成熟的种子，当幼胚出现后长出子叶时，将胚移至含2％蔗糖的b5固体培养基上，3-4叶期时移至土壤中。

第二步，利用细胞学、分子标记杂交后代进行真假杂种鉴定，挑选真杂种。以中双11为轮回亲本，以远缘杂交获得的真杂种做母本，进行回交，在bc1继续采用胚挽救技术获得后代植株(大量挑胚)，获得较多的后代植株，保留所有植株(防止抗性基因的丢失)，利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记(ip13-2)seqidno：1(5‘ttggttgatgctggagat3’；5‘agatttgagggcagacat3’)以及芥蓝中抗根肿病的分子标记seqidno：2(kasp1)(fam：5‘gaaggtgaccaagttcatgctgctcgattcgttcgagaagcg3’；hex:5‘gaaggtcggagtcaacggattgctcgattcgttcgagaagcc3’；com：5‘cgccggaaagggatcgacg3’)去筛选含有白菜与芥蓝抗性的植株，利用中双11与其回交，获得bc2的种子，利用p4生理小种接种该分离群体，同时利用文鼎春蕾中与根肿病抗性相关的分子标记ip13-2以及芥蓝中抗根肿病的分子标记kasp1筛选抗病植株。

第三步，利用100对分布于甘蓝型油菜全基因组的ssr标记对获得的抗病植株进行背景选择，筛选与中双11遗传背景最相似的抗性个体(3-5株)，继续与中双11进行回交，重复bc2代的选育过程，一直到bc5，将选择获得抗性植株自交获得bc5f1，利用p4生理小种接种该群体，筛选抗病植株，同时利用分子标记ip13-2与kasp1检测该分离群体中是否存在白菜与芥蓝的抗性位点。

第四步，将获得同时具有白菜及甘蓝抗性的植株利用ssr标记背景选择，获得与中双11相似度最高的个体，连续自交3代，一直到bc5f4。对bc5f3种子分别用p4与p7生理小种进行接种鉴定，以及利用ip13-2与kasp1检测抗性位点，最终获得具有多个抗性基因、抗多个生理小种的甘蓝型油菜品系。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>利用聚合育种和生物技术合成抗根肿病甘蓝型油菜的方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>36

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ttggttgatgctggagatagatttgagggcagacat36

<210>2

<211>103

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

gaaggtgaccaagttcatgctgctcgattcgttcgagaagcggaaggtcggagtcaacgg60

attgctcgattcgttcgagaagcccgccggaaagggatcgacg103