一种筛选水稻组培材料的方法与流程

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种筛选水稻组织培养材料的方法。

背景技术：

植物组织培养是在人工控制和无菌环境条件下，利用合适培养基对植物组织器官、细胞及原生质体进行离体培养，使其再生成细胞或完整植株的一种生物技术，又称为植物离体培养。近年来，随着植物组织培养技术研究的不断深入，各种植物均可通过合适培养基和培养条件对其不同部位组织器官、细胞及原生质体进行培养形成愈伤组织，进而经分裂、分化、脱分化形成完整植株。因此，组织培养技术的应用越来越普遍，但在愈伤组织培养过程中，组织褐变、水质化(玻璃化)和污染一直是困扰植物组织培养的三大难题。

另外，由于组织培养技术组培耗时长、消耗精力大，如果选择的材料不合适，将面临大量的时间、精力与资源的浪费。因此，组织培养材料筛选的技术为目前研究中的一个迫切需求。

2,4-二氯苯氧乙酸是一种人工合成的植物生长激素，最早广泛应用于控制杂草，简称2,4-d。2,4-d诱导的症状与天然生长激素iaa诱导的症状相似，在低剂量时它促进植物生长，高剂量时导致植物生长异常，最终致使植株死亡。申请人在前期的研究中发现：对不同水稻品种进行2,4-d胁迫生长，发现不同品种水稻在相同浓度2,4-d胁迫下生长状况不同，同时对这些品种水稻种子进行组培，发现其褐化程度也各不相同且与2,4-d胁迫的生长状况之间存在一定的一致性，猜测2,4-d与水稻组培褐化之间存在一定的联系，希望基于此，构建一种鉴定方法，实现对不同批次水稻种子是否适合组培进行初步判断。

技术实现要素：

针对现有技术中的问题，本发明提供了一种筛选水稻组培材料的方法，该方法通过分析2,4-d对水稻种子萌发与幼苗生长的影响因素以及相同品种水稻种子的褐化指数之间的相关性，建立筛选模型，达到了通过2,4-d胁迫对水稻的作用进行筛选合适组培材料的目的。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种筛选水稻组培材料的方法，包括以下步骤：

s1、选取多个品种的水稻种子，每个品种取200～500粒饱满的种子，用含2,4-d的清水萌发水稻种子，种子萌发后，选取各品种萌发后长势一致的水稻幼苗，转移至含相同浓度2,4-d的水稻培养液中水培生长，每2～4d补充一次营养液，培养8～12d后，测量各品种水稻幼苗的株高、根长、sod活性、pod活性，取平均值，分别记为x1、x2、x3和x4。

s2、将上述个水稻品种的水稻胚放入诱导愈伤培养基中，对诱导培养12～17d后形成的愈伤组织进行统计，得到褐化指数y；

s3、利用pearson相关性分析2,4-d对水稻幼苗的影响与诱导愈伤褐化指数的相关性，根据相关性，进行逐步回归分析，建立筛选模型；

s4、取待鉴定的一批水稻种子，每个品种取200～500粒饱满的种子，采用步骤s1所述的方法进行萌发和水培，测量x1、x2、x3和x4，代入步骤s3所述的模型中，计算褐化指数y，当1<y<2时，该批次品种水稻种子适合作组培材料；

其中，步骤s2所述褐化指数y的计算方法为：褐化指数＝∑(每一级褐化数×褐化级数)/(总愈伤数×最高级别)；愈出率＝总愈伤数/总数；所述褐化级别的判断方法为：0级表示没有愈伤组织形成，1级表示有愈伤组织形成但无褐化，2级表示有部分褐化出现且褐化区域小于全部愈伤组织的一半，3级表示褐化区域大于全部愈伤组织的一半但小于全部，4级表示愈伤组织全部褐化。

优选的，步骤s1所述2,4-d浓度为0.01～0.20mg/l；更加优选的，步骤s1所述2,4-d浓度为为0.05mg/l。

优选的，步骤s1所述的多个品种的水稻种子为不同遗传背景水稻种子，所述用于构建模型的品种数目大于6个。

优选的，所述水稻种子进行萌发前需采用次氯酸钠消毒种子表面。

本发明的有益效果为：1)筛选组培材料是判断该批次中哪些品种适合用于组培，根据本发明提供的方法，可以在一定浓度2,4-d的条件下，胁迫不同品种的水稻种子萌发与幼苗生长，测量根长值、sod活性、pod活性，代入模型得到y值，即可判断出该批水稻种子是否适合作为组培材料。2)在组织培养前，实现对组培材料的初步判断，避免了材料选择错误带来的时间、资源的浪费，从而提前降低组培工作量，具有省时、省力、省钱、准确、便捷的优点。

附图说明

图1：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的萌发率；

图2：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的生长状况；

图3：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的株高；

图4：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的主根长；

图5：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的cta活性；

图6：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的sod活性；

图7：不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的pod活性；

图8：愈伤组织褐化程度示意图；

图9：不同品种水稻诱导形成愈伤组织的愈出率、褐化级别、褐化程度；

图10：0mg/l2,4-d的影响与愈伤组织褐变的相关性；

图11：0.05mg/l2,4-d的影响与愈伤组织褐变的相关性；

图12：0.10mg/l2,4-d的影响与愈伤组织褐变的相关性；

图13：0.15mg/l2,4-d的影响与愈伤组织褐变的相关性；

图14：0.20mg/l2,4-d的影响与愈伤组织褐变的相关性。

具体实施方式

为了更好地理解本发明，以下通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

(1)不同浓度2,4-d胁迫水稻萌发

选取品质良好的水稻种子，品种分别为：籼稻5个(9311、明恢63、明恢86、成恢727、旱恢3号)，粳稻3个(h5651、h5741、中花11)。用0.5％次氯酸钠消毒种子表面。用2,4-d浓度依次为0mg/l、0.05mg/l、0.10mg/l、0.15mg/l、0.20mg/l的水溶液浸种，在温室恒温28℃萌发。

待种子萌发后统计发芽率，结果见图1。发现在温度、光照、水分等条件一致的情况下，虽然不同品种之间水稻种子的萌发存在差异，但是同一品种在不同2,4-d浓度时种子萌发率并无明显差异，说明2,4-d对水稻种子的萌发影响比较小。

(2)不同浓度2,4-d胁迫水稻苗期生长

种子萌发后，选取每个浓度萌发后长势一致的水稻幼苗，转移至含200ml国际水稻营养液的培养钵水培生长。营养液中添加2,4-d且浓度与种子萌发时一致，每3d补充一次营养液。

不同浓度2,4-d条件下，水稻的生长状况有明显差异。2,4-d对水稻生长存在显著影响，并且影响程度随2,4-d浓度升高而显著加深。从图2～4可以看出，在2,4-d持续影响下，与不含2,4-d的对照组相比，2,4-d处理组水稻的生长状况受到影响，株高、根长受到抑制。

(3)不同浓度2,4-d胁迫下水稻的抗氧化酶活性

将水稻叶片置于预冷的研钵中，取2ml含1％pvp和0.2mmedta的50mmbps(ph＝7.8)，研磨成浆糊状，在4℃，1200rmp条件下离心30min，用上清液用于酶活性分析。紫外分光光度计测量560nm、470nm、240nm吸光度，根据公式计算出sod、pod、cat酶活性。

图5～7是不同品种水稻在不同浓度2,4-d下的cat、sod、pod活性。可以看出不同浓度2,4-d条件下，sod活性随着2,4-d浓度增加而升高；pod活性在种间的差异较大，在明恢63、明恢86、成恢727、h5651、h5741、中花11品种中，pod活性随2,4-d浓度的增加而升高；而在9311、早恢3号品种中，pod活性随2,4-d浓度的增加而降低；发现cat的活性在明恢63、明恢86、成恢727、旱恢3号品种中随2,4-d浓度的增加而降低；在h5651、h5741、中花11号、9311品种中则变化较小。

(4)诱导形成的愈伤组织褐化程度统计

配制水稻胚诱导愈伤培养基，诱导水稻种子胚形成愈伤组织。对诱导培养15d后形成的愈伤组织进行褐变程度分级统计，如图8所示，0级表示没有愈伤组织形成；1级表示有愈伤组织形成但无褐化；2级表示有部分褐化出现，褐化区域小于全部愈伤组织的一半；3级表示褐化区域大于全部愈伤组织的一半但小于全部；4级表示愈伤组织全部褐化。褐化指数统计结果见图9，统计方法：褐化指数＝∑(每一级褐化数×褐化级数)/(总愈伤数×最高级别)；愈出率＝总愈伤数/总数。褐化级别表示单个愈伤的褐化程度，褐化指数表示整体的褐化情况。

(5)水稻受2,4-d胁迫的影响与愈伤组织褐变的相关性分析

利用pearson相关性分析。分析不同2,4-d浓度下不同水稻品种各特征值与诱导愈伤褐化指数的相关性。根据pearson相关性分析，水稻生长状况和抗氧化酶活性与诱导愈伤组织褐化指数之间存在一定的相关性，达到显著性水平。水稻株高、根长与褐化指数之间存在负相关性，随着2,4-d浓度的增加，相关性先增大后减小，在2,4-d浓度为0.05mg/l的情况下，株高和根长与褐化指数之间相关性最大，分别为-0.635、-0.521。抗氧化酶活性与褐化指数之间存在相关性，其中sod活性与褐化指数之间存在正相关性，随着2,4-d浓度的增加，相关性先增大后减小，在2,4-d浓度为0.05mg/l的情况下，相关性最大0.742；pod活性与褐化指数之间存在负相关性，也在2,4-d浓度为0.05mg/l的情况下，达到最大-0.725；cat活性、发芽率与褐化指数之间无显著相关性。具体结果见图10。

(6)建立筛选模型

根据步骤(6)中水稻受2,4-d胁迫的影响与愈伤组织褐变的相关性分析，株高和根长与褐化指数之间负相关；sod活性与褐化指数之间存在正相关性；pod活性与褐化指数之间存在负相关性；在2,4-d浓度为0.05mg/l的情况下相关性最大。

在2,4-d浓度为0.05mg/l的情况下，统计株高、根长、sod活性、pod活性作为自变量，分别为x1、x2、x3、x4；将褐化级别作为因变量为y；进行逐步回归分析。得到模型如表1：其中模型3的相关系数为0.801最大，r方0.641，调整后r方0.558，回归显著性检验sig＝0.00<0.05说明回归程度显著。非标准化系数下常量为2.054；x3(sod活性)系数0.001；x2(根长)系数-0.104；x4(pod活性)系数-2.068e-005。

表1逐步回归分析模型

注：a.预测变量:(常量),x3。b.预测变量:(常量),x3,x2。c.预测变量:(常量),x3,x2,x4。

非标准系数回归方程如下：

1：y＝0.881+0.001x3+ε

2：y＝1.540+0.001x3-0.114x2+ε

3：y＝2.054+0.001x3-0.104x2-(2.068e-005)x4+ε

根据模型，若要筛选合适组培材料，可以在2,4-d浓度为0.05mg/l条件下胁迫水稻种子萌发与幼苗生长测量根长值、sod活性、pod活性，代入模型3，若1<y<2则该品种在组培时不易发生褐变，适合用于组培。

当然，以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制。除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求保护的范围之内。