一种大麦黄花叶病病毒的幼苗叶片快速接种方法与流程

本发明属于农业技术领域，涉及植物病害接种技术，具体涉及一种大麦黄花叶病病毒的幼苗叶片快速接种方法。

背景技术：

大麦黄花叶病是欧亚冬大麦区的主要病害之一，常发生在我国长江中下游及黄淮冬大麦区，尤以江浙沪地区发病严重。大麦黄花叶病是由大麦黄花叶病毒(barleyyellowmosaicvirus,baymv)、大麦温和花叶病毒(barleymildmosaicvirus,bammv)或两者病毒复合体引起的病毒病。在田间条件下，病毒以土壤中的禾谷多黏菌(polymyxagraminis)作传播介体，从大麦根部侵染发病。因病毒寄存于真菌介体内在土壤中存活的时间长，大麦黄花叶病难以采用化学方法防治。挖掘抗病种质、培育抗病品种是防控该病害最经济有效的途径。该病害抗性主要采取田间抗性鉴定，发病程度受年度间气候影响较大，每年仅能鉴定一次。因此，在室内建立一种大麦黄花叶病病毒的幼苗叶片快速接种方法是必要的。

大麦黄花叶病毒已有的室内接种方法包括常规汁液摩擦接种、喷枪接种及禾谷多粘菌游动孢子接种。常规汁液摩擦接种是将病叶组织在研钵中碾压，再加入少量磷酸缓冲液与石英砂，混匀成含石英砂的病毒汁液，用脱脂棉球或直接用碾碎的植物组织蘸取汁液，在健康大麦幼苗叶片上轻轻摩擦2-3次，一周后重复接种。该方法存在同一叶片正反面需多次摩擦，且接种力度较难掌握，过轻影响接种成功率；力度过重则叶片死亡，不适用大批量样品接种。喷枪接种是利用喷射压力将加入金刚砂的病毒悬浮液喷射在植株叶片表面，该方法速度较快，但操作难度较大，极易难以喷涂的均匀，且设备费用较高，存在安全隐患。无论常规汁液摩擦接种或喷枪接种，在被接种叶片表面残留较多的石英砂或金刚砂易压弯甚至折断幼苗叶片，影响后期的生长。有科研工作者在接种完成后使用清水冲洗残留物，无形中增加工作量、病毒汁液的浓度也会因此降低，影响接种效果；禾谷多粘菌游动孢子接种是通过沙培体系，利用病根粉末与感病品种培养带毒禾谷多黏菌孢子，再将孢子悬浮液中加入经发芽的大麦苗完成接种。其优点是模拟田间自然发病，避免病毒汁液接种淘汰抗真菌介体而不抗病毒的大麦品种的局限性。缺点是体系的构建非常复杂，真菌介体也存在侵染效率的问题，试验误差较大。

因此，急需发明一种简捷、高效的大麦黄花叶病病毒的幼苗叶片接种方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大麦黄花叶病病毒的幼苗叶片快速接种方法，本方法采用棉质手套夹持快速摩擦接种，能够在不影响被接种幼苗正常生长的前提下，简化操作过程、提高接种效率，克服现有接种方法的部分缺陷。

为了达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种大麦黄花叶病苗期室内快速接种方法，包括如下步骤：

选取具有大麦黄花叶病病害特征的大麦，取其大麦黄花叶病病斑明显的绿叶，低温保存备用；

将解冻的病叶与k2hpo4缓冲液、石英砂混合，碾压病叶使其出汁得到病毒汁液；

用灭菌后的棉布手套蘸取病毒汁液及石英砂，从叶片的基部夹住叶片向叶尖端滑动，完成接种。

进一步的，所述大麦病叶的保存条件为-80℃冰箱保存。

进一步的，所述碾压病叶出汁的方法为：将研钵置于冰上预冷，依次加入5-6片解冻后的病叶、1.0mlk2hpo4缓冲液及0.5g石英砂，用钵杵碾压病叶使其出汁。

进一步的，所述接种的步骤为：选取长势一致、健康的幼苗，左手抓住大麦幼苗叶片基部，戴棉质手套的右手食指与拇指蘸取病毒汁液及石英砂，从叶片的基部夹住叶片向叶尖端滑动，整张叶片滑动3次。

进一步的，滑动力度控制为可见适度划痕、表皮细胞微伤。

进一步的，所述接种时期为大麦麦苗二叶一心期。

进一步的，所述k2hpo4缓冲液的ph为9.1。

进一步的，所述k2hpo4缓冲液的浓度为0.1mol/l。

进一步的，所述k2hpo4缓冲液的保存温度为4℃。

进一步的，所述石英砂是以1:1的体积比例混合经150目和200目过滤网过滤的石英砂。

本发明与现有接种方法的比较：

(1)试验步骤简单、操作容易，对接种后的叶片提取总rna，定量后经反转录检测，在总rna一致的前提下，本发明的条带明显较现有方法明亮，表明采用本方法接种的叶片能检测到更多的病毒cdna，本发明涉及的接种方法成功率较高；

(2)食指与拇指夹住叶片，同步完成被接种大麦幼苗叶片正反两面的摩擦接种。常规接种手段需要先接种叶片的一面，再翻转叶片接种背面，因此本发明所述的接种方法比较常规汁液摩擦接种法，效率提高一倍。且大麦黄花叶病毒为rna病毒，离开寄主或者真菌介体存活时间短，本发明的接种方法中病毒离体的时间相应缩短一倍，保持病毒活性，保证接种成功率；

(3)利用棉布手套摩擦接种，蘸取病毒汁液与石英砂的匀浆后，大部分石英砂保留在手套表面的棉纤维间，石英砂主要起磨破叶片表皮的作用，残留在叶片表面很少。能防止一般摩擦法叶片表面残留石英砂过多、损伤幼叶的问题；

(4)棉布手套摩擦接种力度易控制，以迅速滑动为原则，接种叶面损伤少，对幼苗的生长影响小。

附图说明

图1为病毒接种的操作流程图；(从左到右依次为：a、放置病叶、缓冲液与石英砂；b、碾压出汁；c、挤压组织，蘸取汁液；d、轻轻摩擦；e、适度划痕为宜)

图2为接种后填写标签、材料摆放及遮光处理的操作示意图；(从左到右依次为：a、填写标签；b、病毒接种与空白对照组(模拟接种)隔开放置；c、遮光处理)

图3为接种结果的验证；(从左到右依次为：a、baymv分离株；b、bammv分离株；c、扬州病圃单二病叶；d、2019年8月21日常规汁液摩擦接种；e、2019年9月2日常规汁液摩擦接种；f、2019年9月18日采用本发明所述的接种方法进行接种的第一重复；g、2019年9月18日采用本发明所述的接种方法进行接种的第二重复；h、空白对照；i、2000bpmarker)

具体实施方式

实施例1

一种大麦黄花叶病苗期室内快速接种方法，包括如下步骤：

(1)病叶的收集与保存

于大麦黄花叶病发病高峰期，在病圃的感病材料中选取具有典型病害特征的单株，取其大麦黄花叶病病斑明显的绿叶，于-80℃超低温冰箱保存备用。

(2)试剂与用具准备

配置k2hpo4缓冲液(0.1mol/l，ph＝9.1)，置于4℃备用；以1:1的体积比例混合150目和200目的石英砂、棉质手套、研钵与钵杵，在高温灭菌后备用。

(3)病毒制备

将研钵置于冰上预冷，依次加入5-6片解冻后的病叶(约1.0g)、1.0mlk2hpo4缓冲液及0.5g石英砂，用钵杵轻轻碾压病叶、出汁。

(4)病毒接种

在麦苗二叶一心期，选取长势一致、健康的幼苗，左手抓住大麦幼苗叶片基部，戴棉质手套的右手食指与拇指蘸取病毒汁液及少量石英砂，从叶片的基部夹住叶片向叶尖端滑动，整张叶片滑动3次。力度控制在可见适度划痕、表皮细胞微伤为宜。

本发明与现有接种方法的比较：

(1)试验步骤简单、操作容易；

(2)食指与拇指夹住叶片，同步完成被接种大麦幼苗叶片正反两面的摩擦接种。比较常规汁液摩擦接种法，效率提高一倍。且大麦黄花叶病毒为rna病毒，离开寄主或者真菌介体存活时间短，本该方法快速减少病毒离体时间，保持病毒活性，保证接种成功率；

(3)利用棉布手套摩擦接种，蘸取病毒汁液与石英砂的匀浆后，大部分石英砂保留在手套表面的棉纤维间，石英砂主要起磨破叶片表皮的作用，残留在叶片表面很少。能防止一般摩擦法叶片表面残留石英砂过多的问题；

(4)棉布手套摩擦接种力度易控制，以迅速滑动为原则。

实施例2

2019年本发明涉及的一种大麦幼苗期的大麦黄花叶病毒室内摩擦接种方法，并与常规汁液摩擦接种方法比较：

(1)病叶的收集与保存

2019年3月5日，在扬州大学大麦黄花叶病抗性鉴定病圃，取具典型大麦黄花叶病症状的“单二”植株的叶片，收集并置于-80℃超低温冰箱。

(2)常规汁液摩擦接种

分别于2019年8月21日、9月2日采用常规汁液摩擦接种，对处于二叶一心期的“单二”幼苗接种。一周后重复接种，首次接种的一个月后提取rna用于病毒鉴定。

(3)本发明的接种方法

于2019年9月18日采用本发明涉及的接种方法：首先拿出田间收集的5片病叶，置于预冷的研钵中，叶片稍微解冻后，加入预冷的1.0mlk2hpo4缓冲液与0.5g石英砂，用钵杵轻轻碾压出汁。右手戴好灭菌后的棉质手套，用食指与拇指挤压碾压后的病叶组织，蘸取汁液与少量石英砂；左手抓牢大麦幼苗叶片的基部，右手的食指与拇指夹住叶片，从叶片基部迅速向叶尖滑动摩擦3次。接种后填写标签，将幼苗置于人工气候箱遮光24h(温度18℃，湿度80％)。遮光处理结束，幼苗的生长环境严格控制在光照周期14h(光照强度12000lux，温度16℃，湿度80％)、暗周期10h(温度12℃，湿度80％)(图2)，一周后重复接种。首次接种的一个月后，取其新生叶片检测病毒、验证接种效果。

(4)不同接种方法的接种结果比较

采用trizol试剂提取叶片总rna，将所有的rna浓度调至400ng/μl后，反转录获得cdna，采用多重rt-pcr手段鉴定病毒的种类，结果见于图3。由图可知：无论使用常规汁液摩擦接种还是本发明涉及的接种方法，均成功接种。相比较，本发明涉及的接种方法有更明亮的目的条带，表明有更多的病毒cdna，接种效果更好，成功率高，且快速简便。