本发明属于菌根学、微生物学和生态学技术领域，涉及一种建立dse和amf与植物共生体系的方法及其应用，具体为有效建立深色有隔内生真菌和丛枝菌根真菌与植物共生培养体系的方法及其应用。
背景技术：
在自然界中，植物根系会与一定种类的土壤真菌形成互利互惠共生体--菌根。菌根学上菌根主要有丛枝菌根(arbuscularmycorrhizas,am)、外生菌根真菌(ectomycorrhizas,ecm)、内外菌根(ectoendomycorrhizas,eem)、水果鹃类菌根(arbutoidmycorrhizas,arm)、水晶兰类菌根(monotropoidmycorrhizas,mm)、欧石南类菌根(ericoidmycorrhizas,erm)和兰科菌根(orchidmycorrhizas,om)七大类。
其中，丛枝菌根真菌(arbuscularmycorrhizalfungi,amf)能与大部分的陆生植物共生，形成丛枝菌根，使得amf成为陆地上分布最广泛的一类菌根。丛枝菌根真菌侵入植物根系，在根系皮层细胞内形成“丛枝”结构，大部分该类菌根真菌还能形成“泡囊”结构。amf通过其庞大的菌丝网络提高植物对土壤养分和微量矿质元素的吸收以及分泌各种化学物质等，增强植物在生物和非生物胁迫条件下的耐受性和抵抗性。大量研究表明，amf能影响植物对土壤中一些重金属的吸收和积累，通过改变植物的生理生化特征和改善矿质营养等提高宿主植物的重金属耐性。amf有着丰富的生态学功能，但目前其还不能进行纯培养，只能与植物共生培养。amf最常用的接种方法需要以灭菌的沙土作为培养基来进行，此外孢子接种法和根段接种法也可考虑。
在多样性丰富的自然环境中，除各类菌根真菌与宿主植物根系形成的菌根外，还存在部分土壤真菌能于植物根系形成互惠共生体“假菌根”，这种共生体有着类似菌根的生态学功能。其中深色有隔内生真菌(darkseptateendophytes,dse)就是定殖于植物根系组织细胞内或细胞间隙，具有典型横隔膜和微菌核结构的一类明确分类不明确的产分生孢子或无性孢子的小型土壤真菌，属于子囊菌或半知菌。dse广泛分布于全球各种生境，有着强大的生态学功能。dse主要分布在不利的极端环境中，尤其在重金属污染生境中，广泛定植于植物根系，具有很强的重金属耐受性。随着越来越多dse的生态学功能被研究发现，dse已经引起全球的关注。在研究dse-植物-环境相互关系的时候，构建dse-植物共生体系时无菌环境非常重要，然而以往的方法都易遭杂菌污染，且效率低。
关于amf-植物和dse-植物共生体系的相互作用已经有大量研究报道。然而，在很多情况下，植物会与多种土壤真菌形成共生体系，其中在重金属污染地区amf-dse-植物三者共生体系就很常见。在众多研究中，鲜见有报道建立amf-dse-植物三者共生体系的方法和应用。
技术实现要素：
为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种建立dse和amf与植物共生体系的方法及其应用。
根据本发明的一个目的，本发明提供如下技术方案：
一种建立深色有隔内生真菌dse和丛枝菌根真菌amf与植物共生体系的方法，包括如下步骤：
s1，dse和amf的活化和培养
s101，dse的活化、扩繁培养
将低温保存的dse菌株活化后，无菌条件下，接种到盛有马铃薯蔗糖琼脂培养基的培养皿中，于28℃恒温黑暗培养45d；
s102，amf扩繁
将含有amf纯菌种的沙土菌剂与灭菌沙土(w/w3:1)混合后放置于灭菌花盆中，再将无菌植物苗移栽至花盆中，按时浇洒无菌水以保证植物根系正常生长的水分需求，培养90d；
将花盆置于日光下暴晒3d使沙土培养基处于干燥状态，除去植株地上部分，随机选取少量须根用于侵染状况检测,剩余根系75℃烘干粉碎放入沙土培养基中混合后，装入塑封袋进行低温保存；
s2，植物无菌苗的培养
用75％乙醇和10％次氯酸钠对植物种子进行表面消毒，先将植物种子置于75％乙醇侵泡30-60秒，再将种子置于10％次氯酸钠溶液中消毒10min，最后用无菌水冲洗种子4-5次后，再将种子置于无菌水中浸泡20min使种子充分吸水饱胀；
充分吸水饱胀的植物种子接种到垫有无菌水浸湿已灭菌培养皿中，加入水量无菌水，于28℃光照培养箱中暗处理3d，待种子萌发露白大约1cm左右，挑选无污染且生长一致的幼苗备用；
s3，dse和植物共生体系的建立
s301，共生培养基的制备
选取一定规格的圆柱形玻璃容器，定量加入珍珠岩和霍格兰溶液，用无菌透气封口膜封口，于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌1h，取出置于无菌操作台中冷却备用；另取一份河沙灭菌备用；
s302，dse与无菌植物幼苗的接种
无菌条件下，将培养于马铃薯蔗糖琼脂培养基中的dse菌株切成2-3cm的正方形菌快置于圆柱形共生培养基质内，混匀；
在每个共生培养基质中接入2棵无菌幼苗，用培养基将幼苗根部埋好，上部覆一层1cm左右的灭菌沙盖住幼苗，用无菌透气封口膜封住共生培养基质容器口；
s4，dse-植物共生体系的培养
无菌幼苗和dse接种到共生培养基后，于温度20-26℃左右，光照10h，光照强度1000-8000lux的条件下连续培养15d；
s5，dse-植物共生培养体系的检测
共生培养15d，将植物从共生培养基中分离，用蒸馏水冲洗根系3-5次，随机挑选部分根段放入装有10ml10％氢氧化钾氢氧化钾溶液的试管中，于90℃恒温水浴锅中解离2h，取出根段，冷却并置于培养皿中用蒸馏水冲洗3-5次，滴加乳酸中和残留氢氧化钾；
根段采用英雄牌蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂进行染色，乳酸甘油脱色后，将根样剪切成4-5cm，制片并于显微镜下镜检观察dse定殖情况；
当部分根段在镜检下观察到dse的典型有隔内生菌丝时，则表明dse-植物共生体系成功建立；
s6，amf和dse-植物共体系的建立
在灭菌花盆中装入定量的灭菌土壤，在灭菌土壤三分之一厚度处均匀撒上定量的amf菌剂，再覆盖灭菌土壤，将dse-植物共生体移栽至花盆；定时定量浇洒蒸馏水和霍格兰营养液；培养周期视具体植物而定；
s7，amf-dse-植物共生培养体系的检测
将植物从花盆中取出，用蒸馏水洗净根系，放入试管，添加10％氢氧化钾溶液氢氧化钾10ml，于90℃水浴锅解离2h，经蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂染色、脱色以及制片过程后，于显微镜下进行镜检观察amf、dse定殖情况，当部分根段分别有泡囊、丛枝等amf的典型特征的以及侵入点，深色有隔菌丝、微菌核dse的典型结构时，则表明amf-dse-植物共生体系成功建立。
根据本发明的另一个目的，本发明提供如下技术方案：
一种建立dse和amf与植物共生体系方法的应用，方法作为dse和amf与植物的相互关系研究、dse和amf形态学方面的研究，疑似dse和amf菌株初步检测以及dse和amf接种的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明一种建立dse和amf与植物共生体系的方法及其应用，具有高效、简洁、易操作、明确、有序等优点，可用于dse-植物、amf-植物、amf-dse-植物相互关系研究、dse和amf形态学方面的研究，疑似amf、dse菌株初步检测和dse、amf、dse和amf接种的应用。
2、本发明一种建立dse和amf与植物共生体系的方法及其应用，主要侧重于双接种的可实施性和可操作性，对植物根系进行接种的顺序由两种植物根系共生真菌的差异性直接决定。由于dse侵染植物根系时间缓慢、培养周期较长、定殖效率低，且dse自身的定殖特征明显不同于amf，选择透气性好的珍珠岩作为基质，添加改良霍格兰溶液作为营养，满足了dse-植物共生体系建立的营养生长需求。而amf不能纯培养，却易侵染，因而待dse-植物共生体形成后移栽至盛有amf菌剂的灭菌土壤，添加改良霍格兰作为营养液，满足了dse-amf-植物共生体系建立与后期生长的营养需求。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
基于amf和dse两种真菌在培养、定殖特征上的差异，建立起来dse-植物、amf-dse-植物共生体系，经解离、染色、制片后，于显微镜下观察定植情况，初步判断共生体系建立效果。
实施例1
嗜鱼外瓶霉(exophialapisciphilaaccc32496)dse-玉米共生体系培养
1.菌株活化、培养
从冷冻保藏的试管上将嗜鱼外瓶霉菌株活化后，分别接种到含马铃薯蔗糖琼脂马铃薯蔗糖琼脂培养基的平皿中，于28℃恒温黑暗培养45d。
2.玉米无菌苗的培养
用75％乙醇和10％次氯酸钠溶液对玉米种子进行表面消毒，先将种子置于75％乙醇中浸泡30-60秒，再用10％次氯酸钠溶液消毒10min，最后用无菌水冲洗4—5次，置于无菌水中侵泡20min，使种子充分吸水饱胀。充分吸水饱胀的种子接种到垫有无菌水浸湿已灭菌滤纸的无菌培养皿，加入少量无菌水，于28℃光照培养箱中暗处理3d，待种子萌发露白大约1cm左右时，挑选无污染且生长一致的幼苗备用。
3.dse和玉米共生体系的建立
(1)共生培养基制备
dse和玉米的共生培养基质为珍珠岩和河沙，在高25cm，外直径6.5cm的平底玻璃试管中，加入200ml珍珠岩和20ml霍格兰溶液，无菌透气封口膜封口于高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌1h，冷却备用。另取一份100目河沙灭菌备用。
(2)dse和玉米幼苗的接种
在无菌条件下，将培养于马铃薯蔗糖琼脂培养基中的嗜鱼外瓶霉菌株切碎成小片接入共生培养基中，将珍珠岩与菌片混匀，dse接种量为一个玻璃容器中放入10g左右的嗜鱼外瓶霉菌株。在每个共生培养基中接入两颗无菌玉米幼苗，用共生培养基质将幼苗根部埋好，上覆一层灭菌沙盖住幼苗，最后用封口膜封口住玻璃容器。空白对照接种无菌玉米幼苗和相同量的无菌马铃薯蔗糖琼脂马铃薯蔗糖琼脂培养基，平行数与接种嗜鱼外瓶霉菌株的一致，均重复5次。
(3)共生体系的建立
玉米幼苗和dse接种到共生培养基后，于温度26℃，光照时长10h，光照强度1000-8000lux的条件下连续培养15d。所有处理除空白对照组外在1周左右后可以观察到培养基表面和根系表面布满菌丝，颜色变深。培养15d后可以观察到部分玉米须根的颜色呈深色。
(4)共生体系的检测
共生培养15d后，将玉米从共生培养基中分离出来，用蒸馏水冲洗根样3-5次后，将根样放入装有10ml10％氢氧化钾氢氧化钾溶液的试管中，于90℃恒温水浴中解离2h，取出冷却并放于培养皿中用蒸馏水冲洗3-5次，滴加乳酸中和残留氢氧化钾氢氧化钾。根样采用英雄牌蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂进行染色，乳酸甘油脱色后，将根样剪切成4-5cm，制片并于显微镜下镜检观察dse定殖情况。当部分根段在镜检下观察到dse的典型有隔内生菌丝时，则表明dse-植物共生体系成功建立。空白对照未发现dse定植。
实施例2
摩西管柄囊霉(funneliformismosseae)摩西管柄囊霉amf-玉米共生体系培养
1.amf“菌根土”扩繁
将含有摩西管柄囊霉纯菌种的沙土菌剂与灭菌沙土(w/w3:1)混合后放置于灭菌花盆中，在将无菌植物苗移栽至花盆中，按时浇洒无菌水以保证植物根系正常生长的水分需求，培养90d。然后，将花盆置于日光下暴晒3d使沙土培养基处于干燥状态。除去植株地上部分，取少量须根用于侵染状况检测,剩余根系于75℃烘干粉碎放入沙土培养基中混合后，装入塑封袋进行低温保存；
2.amf和玉米共生体系的建立
(1)amf和玉米幼苗的接种
选取高15cm，外直径25cm的花盆灭菌后盛装5kg的灭菌土壤，于土壤三分之一厚度处均匀撒上45g摩西管柄囊霉扩繁土，再上覆灭菌土壤，接入与dse共生培养的空白对照无菌玉米苗两颗，不得分离两颗玉米苗。于温室大棚培养，温度为25℃左右，自然采光。每周喷施50％霍格兰营养液50ml。试验期间采用称重补水的方法维持土壤的含水量在15％，培养周期90d。同时建立空白对照，平行数与接种摩西管柄囊霉菌株的一致。
(2)amf-植物共生培养体系的检测
培养90d后，将玉米从花盆中取出，用蒸馏水洗净根部，放入装有10％氢氧化钾10ml的试管中，于90℃水浴锅解离2h，经染色、脱色、制片过程后，于显微镜下进行镜检观察amf定殖情况，部分根段可见amf的典型结构泡囊、丛枝以及侵入点时，则表明amf-植物共生体系成功建立。
实施例3：嗜鱼外瓶霉(exophialapisciphilaaccc32496)dse-摩西管柄囊霉(funneliformismosseae)amf-玉米共生体系培养
1.dse-amf-玉米共生体系建立
(1)dse和amf与玉米幼苗的接种
前期实施步骤与实施例1相同，使dse-植物共生体成功建立。然后选取高15cm，外直径25cm的花盆灭菌后盛装5kg的灭菌土壤，于土壤三分之一厚度处均匀撒上45g摩西管柄囊霉扩繁土，再上覆灭菌土壤，接入dse共生培养玉米苗两颗，不得分离两颗玉米苗。于温室大棚培养，温度为25℃左右，自然采光。每周喷施50％霍格兰营养液50ml。试验期间采用称重补水的方法维持土壤的含水量在15％，培养周期90d。同时建立空白对照，平行数与接种摩西管柄囊霉菌株的一致。
(2)dse-amf-植物共生体系的检测
培养90d后，将植物从花盆中取出，用蒸馏水洗净根部，放入试管，添加10％氢氧化钾10ml，于90℃水浴锅解离2h，经英雄牌蓝墨水和乳酸甘油混合染色剂染色、脱色以及制片过程后，于显微镜下进行镜检观察amf、dse定殖情况，当部分根段分别有泡囊、丛枝等amf典型结构以及侵入点，深色有隔菌丝、微菌核等dse典型结构时，则表明amf-dse-植物共生体系成功建立。
最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。