多头切花菊瓶内开花的培养方法与流程

本发明属于植物组织培养
技术领域：
，具体涉及多头切花菊瓶内开花的培养方法。
背景技术：
：多头菊又叫多本菊，是菊科(compositae)菊属(chrysanthemuml.)的多年生草本花卉，是我国传统四大名花之一。通常是一株数杆，每杆1花的单株多头菊。多头菊又分为多头盆栽菊和多头切花菊，一般根据花枝数目的不同分为三头菊、五头菊、七头菊或九头菊，均是单数。多头切花菊因其醒目的颜色、优美多姿的花型、瓶插寿命长等优势，观赏价值越来越高。20世纪80年代初，多头切花菊开始越来越向国际市场发展，由于花型种类繁多，花姿优美多样，花色丰富多彩，多用于家庭或商务插花；因此，作为世界上最受欢迎的鲜切花，国内外市场对多头切花菊的需求量越来越大，其经济价值也越来越高。植物瓶内开花可以让人们在任何季节，特别是非开花季节观赏到植物花的开放，瓶内开花的花卉品种多种多样，美丽的花朵在各种工艺瓶内，样式新颖且携带方便，有独特的观赏价值，被称为微型盆景，深受人们喜爱，经济价值越来越高。目前现有技术中并未见有关于多头切花菊瓶内开花的报道。技术实现要素：本发明的一个目的是提供多头菊瓶内开花的培养方法。本发明提供的多头菊瓶内开花的培养方法包括如下步骤：(1)将多头菊的花头作为外植体接种于不定芽培养基中进行培养，直至花头分化出长为5-6cm的不定芽；(2)将所述不定芽切成长为2-3cm且带有1-3个叶芽的茎段，并接种于增殖培养基中进行培养，直至得到5-6cm的菊花小苗；(3)将所述菊花小苗切成长为2-3cm且带有1-3个叶芽的茎段，并接种于开花预培养基中进行培养，得到开花预培养后的菊花苗；(4)将所述开花预培养后的菊花苗切成长为2-3cm且带有1-3个叶芽的茎段，并接种于开花培养基中进行培养，实现多头菊的瓶内开花。上述方法中，所述步骤(1)中，所述不定芽培养基包括6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)和萘乙酸(naa)；所述6-ba在所述不定芽培养基中的浓度可为1.0-1.5mg/l或1.0-1.4mg/l或1.0-1.3mg/l或1.0-1.2mg/l或1.0-1.1mg/l或1.5mg/l或1.4mg/l或1.3mg/l或1.2mg/l或1.1mg/l或1.0mg/l；所述naa在所述不定芽培养基中的浓度可为0.1-0.2mg/l或0.1mg/l或0.2mg/l。进一步的，所述不定芽培养基还包括蔗糖和琼脂。更进一步的，所述不定芽培养基由ms培养基、6-ba、naa、蔗糖和琼脂组成。所述6-ba在所述不定芽诱导培养基中的浓度为1.5mg/l，所述naa在所述不定芽诱导培养基中的浓度为0.1mg/l，所述蔗糖在所述不定芽诱导培养基中的浓度为30g/l，所述琼脂在所述不定芽诱导培养基中的浓度为5g/l。上述方法中，所述步骤(2)中，所述增殖培养基包括6-ba和活性炭；所述6-ba在所述增殖培养基中的浓度可为0.1-0.5mg/l或0.1-0.4mg/l或0.1-0.3mg/l或0.1-0.2mg/l或0.5mg/l或0.4mg/l或0.3mg/l或0.2mg/l或0.1mg/l；所述活性炭在所述增殖培养基中的浓度可为0.3-0.5mg/l或0.3-0.4mg/l或0.5mg/l或0.4mg/l或0.3mg/l。进一步的，所述增殖培养基还包括蔗糖和琼脂。更进一步的，所述增殖培养基由ms培养基、6-ba、活性炭、蔗糖和琼脂组成。所述6-ba在所述增殖培养基中的浓度为0.5mg/l，所述活性炭在所述增殖培养基中的浓度为0.5g/l，所述蔗糖在所述增殖培养基中的浓度为30g/l，所述琼脂在所述增殖培养基中的浓度为5g/l。上述方法中，所述步骤(3)中，所述开花预培养基包括6-ba和蛭石；所述6-ba在所述开花预培养基中的浓度可为0.1-0.5mg/l或0.1-0.4mg/l或0.1-0.3mg/l或0.1-0.2mg/l或0.5mg/l或0.4mg/l或0.3mg/l或0.2mg/l或0.1mg/l；所述蛭石在所述开花预培养基中的浓度可为200-300mg/l或200-280mg/l或200-260mg/l或200-240mg/l或200-220mg/l或300mg/l或280mg/l或260mg/l或240mg/l或220mg/l或200mg/l。进一步的，所述开花预培养基还包括蔗糖和琼脂。更进一步的，所述开花预培养基由ms培养基、6-ba、蛭石、琼脂和蔗糖组成。所述6-ba在所述开花预培养基中的浓度为0.5mg/l，所述蛭石在所述开花预培养基中的浓度为300g/l，所述蔗糖在所述开花预培养基中的浓度为30g/l，所述琼脂在所述开花预培养基中的浓度为5g/l。上述方法中，所述步骤(4)中，所述开花培养基包括改良ms培养基、6-ba、多效唑(pp333)和蛭石；所述改良ms培养基包括1237.5mg/l的nh4no3和255mg/l的kh2po4；所述6-ba在所述开花培养基中的浓度可为0.02-0.05mg/l或0.02-0.04mg/l或0.02-0.03mg/l或0.05mg/l或0.04mg/l或0.03mg/l或0.02mg/l；所述pp333在所述开花培养基中的浓度可为0.1-0.4mg/l或0.1-0.3mg/l或0.1-0.2mg/l或0.4mg/l或0.3mg/l或0.2mg/l或0.1mg/l；所述蛭石在所述开花培养基中的浓度可为200-300mg/l或200-280mg/l或200-260mg/l或200-240mg/l或200-220mg/l或300mg/l或280mg/l或260mg/l或240mg/l或220mg/l或200mg/l。进一步的，所述开花培养基还包括白砂糖和琼脂。更进一步的，所述开花培养基由改良ms培养基、6-ba、pp333、蛭石、白砂糖和琼脂组成。所述6-ba在所述开花培养基中的浓度为0.05mg/l，所述pp333在所述开花培养基中的浓度为0.4mg/l，所述蛭石在所述开花培养基中的浓度为300g/l，所述白砂糖在所述开花培养基中的浓度为50g/l，所述琼脂在所述开花培养基中的浓度为5g/l。上述方法中，所述ms培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示；所述改良ms培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表2所示。上述方法中，所述不定芽诱导培养基、所述增殖培养基、所述开花预培养基和所述开花培养基的ph均为6.0。上述方法中，所述步骤(1)中，所述培养条件如下：培养温度为22±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为14h/d；所述步骤(2)中，所述培养条件如下：培养温度为22±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为14h/d；所述步骤(3)中，所述培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为8h/d，培养时间为40-50天；所述步骤(4)中，所述培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为8h/d。上述方法中，所述步骤(1)前还包括对外植体进行消毒灭菌的步骤；进一步的，所述消毒灭菌的方法包括如下步骤：(a1)将多头菊花头在洗洁精水中浸泡，冲洗；(a2)将(a1)得到的花头在多菌灵溶液中浸泡，冲洗；(a3)将(a2)得到的花头在乙醇溶液中浸泡，冲洗；(a4)将(a3)得到的花头在次氯酸钠溶液中浸泡，冲洗，得到消毒灭菌后的花头；更进一步的，所述步骤(a1)中，所述浸泡的时间可为10min；所述冲洗的时间可为1min。所述步骤(a2)中，所述多菌灵溶液可为多菌灵1000倍液；所述浸泡的时间可为30min；所述冲洗的时间可为1min。所述步骤(a3)中，所述乙醇溶液可为75％(体积分数)的乙醇溶液；所述浸泡的时间可为30s；所述冲洗的次数可为2次。所述步骤(a4)中，所述次氯酸钠溶液可为有效氯为5％的次氯酸钠溶液；所述浸泡的时间可为7-8min；所述冲洗的次数可为6次，每次冲洗的时间可为1min。所述花头可为直径为3cm且开放度为4度的多头菊花头。本发明的另一个目的是提供成套培养基，所述成套培养基由上述不定芽诱导培养基、上述增殖培养基、上述开花预培养基和上述开花培养基组成。本发明还有一个目的是提供上述改良ms培养基。本发明的最后一个目的是提供上述成套培养基或上述改良ms培养基的新用途。本发明提供了上述成套培养基或上述改良ms培养基在如下m1)-m4)中任一种中的应用：m1)多头菊瓶内开花培养；m2)制备多头菊瓶内开花培养的产品；m3)促进多头菊瓶内开花或提高多头菊开花率；m4)制备促进多头菊瓶内开花或提高多头菊开花率的产品。上述方法或应用中，所述多头菊为多头切花菊；所述多头菊品种具体可为纯心。本发明首次以多头菊为材料研究瓶内开花，并探索出了诱导不定芽增殖系数高的外植体花头、适宜多头菊瓶内开花的培养基和光照时间：1)花头是诱导多头菊不定芽的最佳外植体。2)开花培养基：改良ms+6-ba0.05mg/l+pp3330.4mg/l+蛭石300g/l+白砂糖50g/l+琼脂5g/l是诱导多头菊开花的最佳培养基。3)光照时间8h/d是诱导多头菊开花的最佳时间。本发明为菊花的瓶内开花研究提供科学依据。附图说明图1为多头菊以花头为外植体的初代培养过程中的图片。图1a为外植体花头；图1b为刚接进培养基中的外植体花头；图1c为外植体花头初代培养30天的图片。图2为多头菊以花头为外植体的增殖培养过程中的图片。图2a为2-3cm的带芽茎段；图2b为增殖培养30天的图片。图3为多头菊以花头为外植体的开花预培养过程中的图片。图3a为2-3cm的带芽茎段；图3b为开花预培养50天的图片。图4为多头菊以花头为外植体的开花培养过程中的图片。图4a为开花培养20天，顶部出现花蕾；图4b为开花培养40天，花苞膨大至开花。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的多头菊品种纯心是橙色多盟的产品，货号为65178。下述实施例中的洗洁精是上海和蓝白猫有限公司的产品，货号为gb14930。下述实施例中的多菌灵是四川国光农化股份有限公司的产品，货号为hg/t3290。下述实施例中的活性炭是上海农卉生物科技有限公司的产品，货号为180936。下述实施例中的6-苄氨基腺嘌呤(6-ba)是上海农卉生物有限公司的产品，货号为180920。下述实施例中的萘乙酸(naa)是上海农卉生物有限公司的产品，货号为180815。下述实施例中的蛭石是江苏苗哈哈基质有限公司的产品。下述实施例中的多效唑(pp333)是上海农卉生物科技有限公司的产品，货号为180726。下述实施例中的白砂糖是龙州南华糖业有限责任公司的产品，货号为gb/t317。下述实施例中的ms培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表1所示。表1、ms培养基配方序号成分名称用量mg/l序号成分名称用量mg/l1nh4no3165011ki0.832kno3190012na2moo4·7h2o0.253kh2po417013cuso4·5h2o0.0254mgso4·7h2o37014cocl2·6h2o0.0255cacl2·2h2o44015盐酸硫胺素0.16feso4·7h2o27.816盐酸吡哆醇0.57na2-edta37.317烟酸0.58mnso4·4h2o22.318甘氨酸29znso4·7h2o8.619肌醇10010h3bo36.2下述实施例中的改良ms培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质及其浓度如表2所示。表2、改良ms培养基配方序号成分名称用量mg/l序号成分名称用量mg/l1nh4no31237.511ki0.832kno3190012na2moo4·7h2o0.253kh2po425513cuso4·5h2o0.0251mgso4·7h2o37014cocl2·6h2o0.0255cacl2·2h2o44015盐酸硫胺素0.026feso4·7h2o27.816盐酸吡哆醇0.57na2edta37.317烟酸0.58mnso4·4h2o22.318甘氨酸29znso4·7h2o8.619肌醇10010h3bo36.2实施例1、多头切花菊瓶内开花的培养方法供试材料：直径约为3cm且开放度为4度的粉色多头菊(采自浙江海丰花卉有限公司种植基地)。一、外植体选取与消毒灭菌1、外植体的选取分别选用直径约为3cm且开放度为4度的粉色多头菊的花头(图1a)、花瓣和带1个腋芽的1-2cm的茎段(剪去茎段上的花梗和叶片)作为外植体。2、外植体的消毒灭菌每个外植体先在洗洁精水中浸泡10min，取出用自来水流水冲洗1min左右；然后将外植体在多菌灵1000倍液中浸泡30min，取出用自来水流水冲洗1min左右；于超净工作台上再将外植体在75％(体积分数)的乙醇溶液中浸泡30s，取出用无菌水冲洗两次；最后将外植体在有效氯为5％的次氯酸钠溶液中浸泡7-8min，取出用无菌水冲洗6次，每次冲洗1min，得到消毒灭菌后的外植体。二、初代培养以步骤一中消毒后的不同外植体为材料进行不定芽诱导培养，具体步骤如下：将经消毒灭菌后的花头、花瓣和带芽茎段接触药品的部位切除，分别接种于含有不定芽诱导培养基的组培瓶中进行培养，每个组培瓶接种1个外植体，每种外植体接种30个，培养条件如下：培养温度为22±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为14h/d。培养7天后开始观察生长情况，20天后统计不定芽诱导率(增殖系数)。不定芽诱导率＝增殖数/接种数；接种数为接种进不定芽诱导培养基中的总的外植体数目，增殖数为诱导出不定芽的外植体数目。不定芽诱导培养基由ms培养基、6-ba、naa、蔗糖和琼脂组成。其中，6-ba在不定芽诱导培养基中的浓度为1.5mg/l，naa在不定芽诱导培养基中的浓度为0.1mg/l，蔗糖在不定芽诱导培养基中的浓度为30g/l，琼脂在不定芽诱导培养基中的浓度为5g/l。不定芽诱导培养基ph为6.0。图1b为刚接种进不定芽诱导培养基中的花头，图1c为花头初代培养30天的图片。增殖系数统计结果如表3所示。从表3中看出，不同外植体诱导不定芽的效果差异显著。处理2，即以花头为外植体诱导不定芽的增殖系数最高，极显著高于其它处理，增殖系数达18.77。因此，花头是诱导多头菊不定芽的最佳外植体。表3、不同外植体对多头菊幼芽增殖系数的影响处理外植体接种数(株)增殖数(株)增殖系数1花瓣30100.33bb2花头3051618.77aa3带芽茎段30240.87bb注：同列不同的大写字母和小写字母分别表示0.01和0.05水平上差异显著三、增殖培养以花头作为外植体初代培养30天后，外植体花头底部长出1cm左右的不定芽。待不定芽长至5-6cm时，再切成长约为2cm且带有1-3个叶芽的茎段(图2a)，并接种于含有增殖培养基的组培瓶中进行培养，每个组培瓶接种7个茎段。培养条件如下：培养温度为22±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为14h/d。增殖培养基由ms培养基、6-ba、活性炭、蔗糖和琼脂组成。其中，6-ba在增殖培养基中的浓度为0.5mg/l，活性炭在增殖培养基中的浓度为0.5g/l，蔗糖在增殖培养基中的浓度为30g/l，琼脂在增殖培养基中的浓度为5g/l。增殖培养基ph为6.0。图2b为带芽茎段增殖培养30天的图片。四、开花预培养待步骤三增殖培养至得到不定芽长为5-6cm的菊花小苗时，将菊花小苗切成长约为2cm且带有1-3个叶芽的茎段(图3a)，接种于含有开花预培养基的组培瓶中进行培养，每个组培瓶接种7个茎段。培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为8h/d。开花预培养基由ms培养基、6-ba、蛭石、琼脂和蔗糖组成。其中，6-ba在开花预培养基中的浓度为0.5mg/l，蔗糖在开花预培养基中的浓度为30g/l，琼脂在开花预培养基中的浓度为5g/l，蛭石在开花预培养基中的浓度为300g/l。开花预培养基ph为6.0。图3b为带芽茎段开花预培养50天的图片。五、开花培养1、不同培养基及激素浓度对多头菊瓶内开花的影响将开花预培养50天后的菊花苗，切成2cm左右且带有1-3个叶芽的茎段，分别接种于含有不同开花培养基(表2)的组培瓶中进行培养，每个组培瓶接种7个茎段。培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间为8h/d。采用三因素随机区组试验设计开花培养基，基本培养基分别设置为改良ms培养基和ms培养基；6-ba浓度为0.05mg/l；pp333浓度分别设置为0mg/l、0.1mg/l、0.2mg/l、0.3mg/l和0.4mg/l；蔗糖浓度为50g/l；琼脂浓度为5g/l。不同开花培养基的ph均为6.0。开花培养15天后开始观察瓶苗的生长状况，统计菊花苗开花数、开花率、平均株高及生长情况。开花率＝开花的株数/接种的总的带芽茎段数。结果如表4所示。从表4中看出，不同培养基及激素浓度配比对多头菊开花的效果差异显著。处理7，即开花培养基：改良ms+6-ba0.05mg/l+pp3330.4mg/l+蛭石300g/l+白砂糖50g/l+琼脂5g/l的开花率极显著高于其它处理组，达76.5％，平均株高为2.3cm，植株茎秆粗壮，节间短，叶片浓绿较大，根粗壮。其中，处理2、3、4、6与处理8、9、10、11相比，开花率显著提高，没有经过改良的ms开花株数为0，说明改良ms对诱导开花起着关键性的作用。处理1到处理6相比，随着pp333浓度的增加，株高越来越矮，开花率越来越高，说明pp333的浓度对多头菊的开花起着促进作用。处理5、7与处理4、6相比，开花率显著提高，植株的生长状态也更好(植株茎秆粗壮，节间短，叶片浓绿)，说明蛭石对多头菊的开花和生长状况有着促进作用。因此，开花培养基：改良ms+6-ba0.05mg/l+pp3330.4mg/l+蛭石300g/l+白砂糖50g/l+琼脂5g/l是诱导多头菊开花的最佳培养基。表4、不同培养基及激素浓度对多头菊瓶内开花及株高的影响注：同列不同的大写字母和小写字母分别表示0.01和0.05水平上差异显著2、不同光照时间对多头菊开花的影响将开花预培养50天后的菊花苗，切成2cm左右且带有1-3个腋芽的茎段，接种于含有开花培养基(表2中的处理7)的组培瓶中进行培养，每个组培瓶接种7个茎段。培养条件如下：培养温度为25±2℃，光照强度为2000lx，光照时间分别设置为8h/d、10h/d、12h/d。开花培养15天后开始观察瓶苗的生长状况，统计开花数和开花率。开花数和开花率统计结果如表5所示。从表5中看出，不同光照时间对多头菊开花的影响效果差异显著。处理1，即当其它培养条件一致，光照时间为8h/d时，多头菊的开花率极显著高于其它处理组，达63.9％，随后随着光照时间的增加，开花率越来越低，甚至不开花，说明光照时间的长短对开花率的高低具有重要的影响作用。因此，光照时间8h/d是诱导多头菊开花的最佳时间。在光照时间8h/d条件下，开花培养20天后，小苗高度达4cm左右，于株顶出现花蕾(图4a)，花蕾直径约为2mm；开花培养40天，花苞膨大至开花(图4b)。表5、不同光照时间对多头菊瓶内开花的影响处理光照时间(h)接种数(株)开花数(株)开花率％181207463.9aa2101201815.7bb31212000cc注：同列不同的大写字母和小写字母分别表示0.01和0.05水平上差异显著以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12