一种筛选高香气烟草品种突变体的方法与流程

本发明属于生物技术领域，属于烟草地新品种培育技术，特别是涉及一种筛选高香气烟草品种突变体的方法。

背景技术：

提高烟叶的香气品质是烟草育种的永恒的主题。传统的杂交育种，由于性状连锁，有性杂交难以得到经济性状良好的抗逆、抗病栽培品种，而且常规育种历时长，分化速度迅速，往往超过品种更新换代时间。

烟草茎叶腺毛密布，种类繁多，包括长柄多细胞腺、短柄多细胞、单细胞等等。其中长柄多细胞腺毛腺头腺毛分泌最为旺盛，分泌物则以双萜化合物为主。杨铁钊以叶面分泌物为指标，筛选到高腺毛分泌物材料y892，选育出高香气品种“豫烟10”，也证明叶面化学对烟叶香气和抗性的重要意义。

甲基磺酸乙酯(ems)是植物中最常用的一种稳定、高效的化学诱变剂，主要诱发产生点突变，主要是c突变为t，从而导致c/g转变为t/a。

随着现代分子生物学的发展和转基因技术的日趋完善，人们试图鉴定、克隆与香气有关的基因，研究其表达、调控机制，再通过转导技术将其导入目标品种，以克服种间不亲和，缩短育种年限。

但迄今为止，利用基因工程培育新品种仍存在安全性争议：外源基因的整合表达对于烟草之类的经济作物的经济性状有无影响？来源于细菌、昆虫的毒性基因有无人体的危害？既要理论上是安全的，也要克服大众的心理障碍，更主要的对外贸易、进出口的影响。由此看来，通过基因工程的途径在短期内还难以根本解决问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种筛选高香气烟草品种突变体的方法，以解决传统杂交育种由于性状连锁及培育时间长的问题，同时也能够解决转基因所存在的安全性不能确定，消费者存在心理障碍等问题。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种筛选高香气烟草品种突变体的方法，包括以下步骤：

s1、创制烟草突变一代群体：

通过ems诱变方法创建m1代植株；

s2、叶面化学突变体的室内筛选：

通过对m1代植株的叶片进行第一特定性检测，选择符合第一设定标准的m1代植株为初筛突变株系，并收获所述初筛突变株系的种子进行培育；

s3、将由初筛突变株系的种子的植株，在不同生态条件的烟区种植，直接进入烟草新品种的田间选育程序；

s4、将田间选育植株进行第二特定性检测，筛选出符合第二设定标准的田间选育植株为突变株系。

一种筛选高香气烟草品种突变体的方法，包括以下步骤：

s1、创制烟草突变一代群体：

通过ems诱变方法创建m1代植株,并收获相应的m2代种子；

s2、叶面化学突变体的室内筛选：

利用ems诱变方法处理m2代种子并获得m2代植株，通过对m2代植株的叶片进行第一特定性检测，选择符合第一设定标准的m2代植株为初筛突变株系，并收获所述初筛突变株系的种子进行培育，以获取m3代种子；

s3、将所述m3代种子的m3代植株，在不同生态条件的烟区种植，直接进入烟草新品种的田间选育程序；

s4、将田间选育植株进行第二特定性检测，筛选出符合第二设定标准的田间选育植株为突变株系。

所述ems诱变方法为：

利用设定质量百分比浓度的ems处理待处理种子第一设定时间，并使得处理后种子的致死率为50％左右。

所述ems的质量百分比浓度为0.8％，第一设定时间为8小时。

所述第一特定性检测的方法包括以下步骤：

1)叶面腺毛形态学检测：

筛选长柄多腺头分泌型腺毛的突变体进行标记；

2)叶面组织化学检测：

采取组织化学染色法，利用罗丹明对叶面化学物质中糖脂成分进行染色，通过显微观察，直接筛选分泌物较高的所述突变体；

3)腺毛基因表达检测：

提取叶面腺毛rna，根据西柏烷合成基因cbt和cyp71d16设计引物进行rt-pcr检测分析，筛选腺毛分泌物生物合成旺盛的叶面所对应的突变株系；

4)腺毛分泌化学成分检测：

采用有机溶剂萃取法，提取叶面分泌物，利用紫外吸收法检测叶面化学成分总量，并判断该叶面化学成分总量是否达到设定标准值，若没有达到设定标准值，则弃用该叶面对应的突变株系；

若达到或超过设定标准值，则进一步用gc/ms法检测西柏烷类腺毛分泌物的含量变化，筛选含量变化高的叶面对应的突变株系留种。

所述叶面腺毛形态学检测包括利用显微技术对腺毛密度进行筛选、利用扫描电镜技术对腺毛类型进行筛选及利用荧光显微技术对腺毛细胞中叶绿素含量进行筛选。

所述第二特定性检测包括但不限于叶面腺毛形态学检测、腺毛分泌化学成分检测、烤后烟叶化学成分测定、烤后叶片香气物质测定及感官质量评价。

所述感官质量评价的指标包括香气质、香气量、浓度、柔细度、余味、杂气、刺激性和劲头；

所述感官质量评价总分计算公式为：

t＝(a+b)×2.0+(c+d)×1.5+e+f+g+h，其中，t为感官质量评价总分，a为香气质得分，b为香气量得分，c为浓度得分，d为柔细度得分，e为余味得分，f为杂气得分，g为刺激性得分，h为劲头得分。

本发明的有益效果是：

本技术方案的筛选高香气烟草品种突变体的方法，通过有效利用突变体筛选是目前烟草香气和抗性改良最简便、有效、切实可行的途径之一。

附图说明

图1为ems突变体叶面腺毛密度观察照片；

图2为ems突变体叶面腺毛密度统计图；

图3为烟草叶面腺毛扫描电子显微镜观察照片；

图4为叶绿素荧光观察对比照片图；

图5为叶面组织化学染色结果对比照片图；

图6为不同分泌类型腺毛cbt基因表达示意图；

图7为叶面分泌物色谱分析图；

图8为本发明筛选高香气烟草突变体流程图；

图9为突变株系与对照系叶面腺毛密度比较图；

图10a为叶面西柏烷类化合物含量比较图；

图10b为叶面烷烃类化合物含量比较图；

图10c为叶面蔗糖酯类化合物含量比较图；

图11a至图11h不同株系中性香气成分含量分析图。

具体实施方式

以下通过实施例来详细说明本发明的技术方案，以下的实施例仅是示例性的，仅能用来解释和说明本发明的技术方案，而不能解释为是对本发明技术方案的限制。

本申请的各实施例是以正常中烟100品种为基础进行的培育，因为篇幅的原因，不能对其它品种进行一一说明，但并不是说本申请的技术方案仅适用于中烟100品种的选育，为了实际的需要，可以依据本技术方案对其它烤烟品种进行选育。本申请的筛选包括有两种方法，一种是仅使用一次ems诱导方法处理，然后对处理后种子的植株进行检测，第二种是在上一种的基础上，对所获得的种子再次进行ems诱导处理，然后再进行检测。

本实施例是以一次ems诱导处理后进行筛选进行说明，若使用两次ems诱导处理与本实施例的区别是多了一次ems诱导，其它的检测方法相同。

如图8所示，选择长势良好的中烟100为诱变对像，使用质量百分比浓度为0.8％的ems处理其种子8小时，使得处理后的种子的致死率为50％左右，并利用处理后的种子获得m1代植株，将m1代植株种于试验田中，当这样m1代植株移栽45天时，选取长势较好的200株个体，取各植株中部叶片进行第一特定性检测，从诱变体后代中获得腺毛密度高、分泌能力强的突变植株2份，将两个突变株系的第3代种子进行育苗(无分离现象)，并进行大田栽培，大田栽培植株即为ems诱变后代。

具体的第一特性检测为：

1)叶面腺毛形态学检测：

筛选具有较高、长柄多腺头分泌型腺毛的突变体进行标记。

(1)利用显微技术对腺毛密度进行筛选：

撕取叶片(10cm长)下表皮，置于载玻片上，用35mmol/l番红水溶液染色10-15min，流水冲洗至无色，用motic显微镜(视野面积为0.015386cm²)观察腺毛数量，移动镜台对样品进行扫描，每片连续扫描三个视野。这3个观察值平均数代表每个样品的腺毛密度值在体式镜下进行观察和计数，如图1和图2所示。

(2)利用扫描电镜技术对腺毛类型进行筛选：

采用环境扫描电镜(vegaⅱlmu，tescan公司，捷克)进行腺毛类型的观察和比较。该电镜采用气体二次电子成像，工作电压20kv，工作距离21mm，样品室和镜筒状态选用高真空(10-6pa)。利用该技术可以对候选材料进行腺毛类型的精确鉴定，如图3所示。

(3)利用荧光显微技术对腺毛细胞中叶绿素含量进行筛选：

长柄腺毛具有发达的叶绿体和强烈的叶绿素荧光，短柄腺毛及非分泌腺毛无叶绿体和叶绿素荧光。在叶尖撕取表皮制作水装片，利用bx51型奥林巴斯显微镜，首先用油镜观察，随后在蓝色荧光(560nm)下观察，通过荧光的强烈程度来筛选腺毛类型突变，如图4所示。

2)叶面组织化学检测：

蔗糖酯与罗丹明发生化学反应后，形成玫瑰红色的复合物。因此，利用罗丹明对新鲜叶片进行染色，叶面分泌物中的糖脂成分将呈现红色。利用这一反应可以对分泌蔗糖酯的腺毛进行标记，通过着色深浅判定叶面腺毛的分泌能力，进而筛选叶面分泌物较为丰富或稀少的突变体。

采取烟叶样品用0.2％(w/v)罗丹明水溶液染色60min，将染色后的叶片用清水依次清洗20sec，去除未结合的罗丹明溶液。置于体视显微镜下观察、拍照(图5)。对分泌型t.i1068的腺毛染色显示腺毛着色重，腺头呈现玫瑰红的颜色。而非分泌型c110的腺毛则基本没有着色。

3)腺毛基因表达检测：

西柏三烯一醇合酶基因cbt能催化ggpp形成西柏三烯一醇，而cyp71d16催化西柏三烯一醇脱氢生成西柏三烯二醇。二者均在烟草腺毛的腺头细胞中表达，是烟草腺毛分泌物合成的关键酶基因。因此，cbt与cyp71d16基因的表达情况可以反映出烟草腺毛分泌物的合成能力。

腺毛收集：选取烟株上部幼嫩叶片，取下后迅速用灭菌的剪刀剪成3x5mm²的方形小块，叶片小块迅速转移至液氮预冷的1.5ml无酶离心管中，保持约2-3cm²叶片/管。将离心管放入液氮中，低温固定30s。向管中装入约1-1.5ml粉状新鲜、清洁、足够细碎的干冰，使用pv-1涡旋振荡器(grant公司，英国)震荡研磨30s，转速3000rpm。震荡后的混合物用灭菌的40目滤网(网孔直径0.425mm)过滤，待干冰即将挥发完时迅速加入液氮研磨。每个样品收集约100cm²叶片的腺毛。

rt-pcr：rna提取使用qiagen公司的rneasyplantminikit试剂盒，反转录使用newbioindustry公司生产的m-mlv反转录酶，反转录的cdna用于rt-pcr检测。所用引物为现有引物。其中内参基因l25是烟草核糖体蛋白。对烟草不同分泌型遗传材料的腺毛分泌物相关基因的表达分析如图6所示，可以看出，cbt基因在分泌型腺毛中高表达，在非分泌腺毛中不表达，该基因可作为腺毛分泌能力的分子标记。

4)腺毛分泌化学成分检测：

腺毛主要分泌的是西柏烷类二萜化合物、糖脂、烷烃类等。使用有机溶剂对烟叶表面化学成份进行萃取并进行gc/ms检测，可以对烟草腺毛分泌物的含量和组分进行准确筛选。

萃取：鲜烟叶叶面成分提取采用二氯甲烷提取，后加入内标1ml(2.020mg/ml的蔗糖八乙酸酯和2.542mg/ml的正十七烷醇的混合溶液)，旋转蒸发仪浓缩，利用紫外吸收法检测叶面化学成分总量，并判断该叶面化学成分总量是否达到设定标准值，若没有达到设定标准值，则弃用该叶面对应的突变株系。

若达到或超过设定标准值，则进一步用gc/ms法检测西柏烷类腺毛分泌物的含量变化，筛选含量变化高的叶面对应的两个突变株系留种。

gc/ms检测：色谱仪为hp-5890，质谱仪是vc-70se。gc条件：色谱柱：db-5msui石英毛细管柱(30m×0.25mmi.d.×0.25μmd.f.)；进样口温度：250℃；程序升温：40℃保持2min，然后以6℃/min升温至180℃保持2min，以2℃/min升温至280℃保持20min；载气：高纯氦气，载气流速：恒流0.8ml/min；进样量：1.0μl，分流比：15:1。ms条件：传输线温度：250℃；ei离子源温度：280℃；电离能量：70ev；质量数范围50-650amu；检索谱库：nist08。图7为叶面分泌物色谱分析图，其中，a1：α-西柏三烯一醇；a2：β-西柏三烯一醇；b1：α-西柏三烯二醇；b2：β-西柏三烯一醇；b3-b5：西柏三烯二醇(同分异构体)。

本申请的实施例中，选用两个突变株系的第三代种子进行育苗(无分离现象)，分别命名为ems-1、ems-2，并进行大田栽培，以中烟100正常后代和nc89作为对照，其中nc89为中烟100的突变后代，且为河南主栽品种。

试验在河南省洛阳市烟草公司烟叶科技园(洛宁县小界乡王村)进行。试验共设ems-1、ems-2、中烟100和nc89等4个处理，每个处理300株，采用随机区组设计，每个处理重复3次。小区面积130m²(10行区)，株行距50cm×120cm，大田管理依据优质烟叶栽培技术规范进行，移栽的烟苗发育良好，整齐度高。各处理施肥水平根据当地烟草生产技术方案要求进行，主要包括：烟草专用复合肥(n:p2o5:k2o＝5:6:9)300kg/hm²，重钙225kg/hm²，饼肥375kg/hm^-2，硝酸钾75kg/hm²。

并对上述的株系进行第二特定性检测，包括叶面腺毛形态学检测、腺毛分泌化学成分检测、烤后烟叶化学成分测定、烤后叶片香气物质测定及感官质量评价。

叶面腺毛形态学检测：

在旺长期取15cm长的顶部叶片，撕取叶片下表皮，置于载玻片上，观察腺毛数量，用nikon500体视显微镜(nikon公司，日本)移动镜台对样品进行扫描，每片连续扫描3个视野。取3个观察值的平均数代表该样品的腺毛密度值，分别确定视野面积后在体式镜下进行观察和计数，如图9所示。

腺毛分泌化学成分检测：

在成熟期取中部叶(10-12叶位)进行叶面分泌物的提取和测定，取成熟的中部叶沿中脉两侧截取直径为10cm的叶圆片，每个处理取20个叶圆片，并依次将圆片在1000ml二氯甲烷中浸提，每次浸提2s，重复3次，加入含正十七烷醇内标1ml，得到的浸提液经过滤、旋转蒸发仪浓缩、氮吹仪吹干、硅烷化处理后，采用气质联用分析仪(色谱仪型号hp-5890，质谱仪型号vc-70se)分离、分析，并通过检索谱库(nist08)确定成分。萃取叶面化学成分，用紫外分光光度计法测定叶面化学成分总量，用autosystemxlgc配fid检测器和自动进样器(美国pe公司生产)、turbomass色质联用仪(美国pe公司生产)检测分泌物组分和含量，如图10a-10c所示。

烤后烟叶化学成分测定：

取c3f等级的烤后烟叶研磨后过60目筛，以二氯甲烷为萃取剂进行香气物质的萃取，装置偏高的一端连接盛有20g烟末及600ml蒸馏水的1000ml平底烧瓶，并加2.0g柠檬酸，使用电热套加热；装置的另一端接盛有40.0ml二氯甲烷的250ml烧瓶，并加入内标(2.020mg/ml的蔗糖八乙酸酯和2.542mg/ml的正十七烷醇的混合溶液)液1ml，该端在水浴锅中加热，水浴温度为60℃。同时蒸馏萃取2.5h，萃取完成后，向二氯甲烷溶液中加入约10g无水硫酸钠，干燥至少6h，将上清液转入鸡心瓶中于旋转蒸发仪(水浴温度设置为48℃，不超过50℃)浓缩至1ml，转入到色谱瓶中，采用autosystemxlgc配fid检测器和自动进样器(美国pe公司生产)、turbomass色质联用仪(美国pe公司生产)分析香气物质成分，见表1。不同株系中性香气成分含量分析见图11a-11h。

感官质量评价：

由评吸委员会成员采用感官质量评吸法对ems诱变突变后代的感官质量进行评定，各项感官指标项目评价按照9分制，感管总分是各项实际得分乘以权重之和。其中各项指标分别为香气质、香气量、浓度、柔细度、余味、杂气、刺激性和劲头.

感官质量评价总分计算公式为：

t＝(a+b)×2.0+(c+d)×1.5+e+f+g+h，其中，t为感官质量评价总分，a为香气质得分，b为香气量得分，c为浓度得分，d为柔细度得分，e为余味得分，f为杂气得分，g为刺激性得分，h为劲头得分，结果见表2。

通过ems诱变可以获得腺毛密度提高、分泌能力增强的突变体；获得的多腺毛突变体中，ems-2突变株系性状最好，其主要特点有：腺毛密度分别是中烟100(37.19个/mm²)和nc89(56.06个/mm²)的1.8倍和1.2倍，腺毛分泌能力较强，叶面分泌物含量高，烤后化学成分较协调，香气物质含量(890.32μg/g)分别比中烟100(661.94μg/g)和nc89(690.19μg/g)增加34.5％和29％，ems-2诱变株系可作为候选品种或种质资源用于后期的品种筛选、选育等研究中。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变形，本发明的范围由所附权利要求及其等同限定。