一种抗TMV药剂的筛选方法与流程

本公开涉及病毒抑制剂筛选
技术领域：
，具体涉及一种抗tmv药剂的筛选方法。
背景技术：
：烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus,tmv)，为单链rna植物病毒，是目前世界上危害最严重的10种植物病毒之一，该病毒能够感染包括十字花科、茄科、豆科、苋科等36科350多种植物，导致严重的植物病害。心叶烟是tmv的抗病品种，受到tmv侵染后会在48h内产生枯斑。枯斑的大小和数量可以说明病毒浓度、侵染力的强弱。药剂对病毒的抑制作用越强，产生的枯斑数量就越少，因此可根据枯斑的数量判断药剂的抗病毒活性。针对tmv在农业生产中造成的严重危害，建立以心叶烟为主体的筛选体系，从植物提取物或微生物代谢物中初步筛选出具有抗tmv活性的药剂。目前生产上抗tmv病毒的单剂品种十分有限，而且许多单剂并不具有抗tmv病毒的作用，因此筛选有效的抗tmv病毒单剂在实践和理论研究上都十分有意义，即便是筛选出单剂的作用效果低于商品药剂，也仍然可能具有复配价值。但是目前筛选抗tmv药剂的方法具有很多的问题，例如：在接种tmv病毒时，对接种叶片的选取没有明确要求，这样导致的实验误差较大；摩擦接种处理后的培养条件不够合理，往往出现枯斑过大或连片等情况，直接影响筛选结果的准确性和稳定性；接种的tmv病毒浓度和病毒量不够合理，实验后产生枯斑的数量过多或过少，不利于进行统计并且会导致筛选结果的不稳定。技术实现要素：本公开的目的是提供一种抗tmv药剂的筛选方法，以达到提高筛选结果的稳定性及准确性的目的。为实现上述目的，技术方案如下：一种抗tmv药剂的筛选方法，所述筛选方法的具体操作步骤为：(1)选取5-6叶期的心叶烟幼苗，在筛选前一天去除顶芽，选取同一位置的叶片作为接种叶；(2)在接种叶的表面上均匀的喷洒一层金刚砂，然后取浓度为3ng/μl的tmv病毒溶液到接种叶的左右半叶面上涂抹均匀，进行摩擦接种；(3)完成接种后静置，然后对接种叶面进行清洗；(4)待清洗后的接种叶片干后，采用半叶枯斑法在接种叶的一侧表面均匀涂抹上待测抗tmv药剂，另一侧添加相同体积的灭菌水作为对照；(5)将处理好的心叶烟进行培养，48h后对接种叶进行观察，记录左右两侧半叶上的枯斑数目，计算枯斑抑制率，对比分析待测抗tmv药剂对tmv的抑制效果，枯斑抑制率的公式为：其中y代表待测抗tmv药剂对心叶烟产生枯斑的抑制率，c为对照枯斑总数，a为接种叶片涂抹待测抗tmv药剂一侧的枯斑总数。所述步骤(2)中金刚砂的目数为600目。所述步骤(2)中摩擦接种的具体操作为：将叶片上的病毒溶液轻轻涂抹均匀后，然后从主叶脉开始顺叶脉方向向叶片边缘进行摩擦接种，重复摩擦2-3次，摩擦力度不宜过重，使叶片产生微创即可，左右半叶用相同力度摩擦。所述步骤(3)中静置的时间为15min，所述清洗的时间为2-4s。所述步骤(4)中待测抗tmv药剂的浓度为500μg/ml，添加量为40μl。所述步骤(5)中心叶烟培养的温度为22℃。本公开的有益效果是：提供了一种抗tmv药剂的筛选方法，所述方法中选取5-6叶期心叶烟幼苗，在实验前一天去除顶芽，并选取相同位置的叶片作为接种叶，这样可以保证筛选的一致性和稳定性；在筛选前一天去除顶芽，可以去除幼苗的顶端优势，顶芽会影响接种叶的生长，去除顶芽可使接种叶优先生长，解决了接种叶生长状态对筛选结果有影响的问题；在所述方法中对tmv病毒的浓度和病毒量进行了优化，所产生的枯斑数量控制在120个枯斑左右，这样使得筛选的结果更具说服力，操作的重复性也更好，且采用半叶枯斑法进行抗tmv药剂的筛选，其中接种叶片主叶脉分界的左右半叶生理状态相同，这样就可以减少叶片本身对筛选结果的误差。本公开所述的一种抗tmv药剂的筛选方法，对接种后的心叶烟培养的条件进行了优化，在22℃的培养条件下，接种叶片上的枯斑数量稳定，且不会出现连片的情况，产生的枯斑清晰可见，方便统计，最大限度地减少实验误差，保证了筛选数据的可靠性。附图说明图1为实施例1不同浓度tmv病毒液接种心叶烟后的接种叶上的症状图。图2为接种后心叶烟不同培养温度下接种叶的症状图。图3为实施例3宁南霉素8％药剂抗tmv效果图。具体实施方式以下各步骤仅用以说明本公开的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各步骤对本公开进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各步骤所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本公开各步骤技术方案的范围。实施例1一种接种tmv的方法，其中所述方法的具体操作步骤为：(1)选取4棵长势一致5-6叶期去顶处理的心叶烟为供试寄主，每棵接种一个叶片，选取长势较好的新生叶片作为接种叶，4棵供试心叶烟的接种叶选取同一叶位的叶片；(2)将提纯后的tmv病毒用0.01m的磷酸盐缓冲液稀释到浓度为3ng/μl的病毒溶液，在选好的接种叶片表面均匀喷洒薄薄一层600目金刚砂，用移液枪分别吸取20μl浓度为1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、5ng/μl的tmv病毒溶液打到接种叶的左右半叶，用手指将叶片上的病毒溶液轻轻涂抹均匀，然后从主叶脉开始顺叶脉方向向叶片边缘进行摩擦接种，重复摩擦2-3次，摩擦力度不宜过重，使叶片产生微创即可，左右半叶用相同力度摩擦；(3)接种完15min后用洗瓶将接种叶片按接种时摩擦方向进行冲洗，冲洗时间控制在3s；(4)将处理好的的心叶烟放到温度27℃，湿度75％，光照70％的培养箱中培养，48h后观察，分别记录左右半叶的枯斑数目，并拍照记录。结果如图1(a为1ng/μl，b为2ng/μl，c为3ng/μl，d为5ng/μl)所示，根据图1可以看出在tmv接种浓度为3ng/μl时，接种叶面上的枯斑的数量和大小更加的均匀。实施例2一种接种tmv的方法，其中所述方法的具体操作步骤为：(1)选取4棵长势一致5-6叶期去顶处理的心叶烟为供试寄主，每棵接种一个叶片，选取长势较好的新生叶片作为接种叶，4棵供试心叶烟的接种叶选取同一叶位的叶片；(2)将提纯后的tmv病毒用0.01m的磷酸盐缓冲液稀释到浓度为3ng/μl的病毒溶液，在选好的接种叶片表面均匀喷洒薄薄一层600目金刚砂，用移液枪分别吸取20μl浓度为3ng/μl的tmv病毒溶液打到接种叶的左右半叶，用手指将叶片上的病毒溶液轻轻涂抹均匀，然后从主叶脉开始顺叶脉方向向叶片边缘进行摩擦接种，重复摩擦2-3次，摩擦力度不宜过重，使叶片产生微创即可，左右半叶用相同力度摩擦；(3)接种完15min后用洗瓶将接种叶片按接种时摩擦方向进行冲洗，冲洗时间控制在3s；(4)将处理好的的心叶烟分别放到温度20℃、温度22℃、温度24℃和温度28℃的培养箱中培养，其中湿度为75％，光照为70％，48h后观察，分别记录左右半叶的枯斑数目，并拍照记录。结果如图2(a为温度20℃，b为温度22℃，c为温度24℃，d为温度28℃)所示，根据图2可以看出在接种后的心叶烟在培养温度为22℃时，接种叶面上的枯斑的数量和大小更加的均匀。因此在筛选抗tmv药剂时，tmv病毒的接种浓度为3ng/μl，接种后培养心叶烟的温度为22℃时，在接种叶上产生的枯斑数量和大小最佳，也最稳定，大大改善了筛选结果的稳定性和准确性。实施例3一种抗tmv药剂的筛选方法，所述筛选方法的具体操作步骤为：(1)选取6棵长势一致5-6叶期去顶处理的心叶烟为供试寄主，每棵接种一个叶片，选取长势较好的新生叶片作为接种叶，6棵供试心叶烟的接种叶选取5叶位的叶片；(2)将提纯后的tmv病毒用0.01m的磷酸盐缓冲液稀释到浓度为3ng/μl的病毒溶液，在选好的接种叶片表面均匀喷洒薄薄一层600目金刚砂，用移液枪分别吸取20μl浓度为3ng/μl的tmv病毒溶液打到接种叶的左右半叶，用手指将叶片上的病毒溶液轻轻涂抹均匀，然后从主叶脉开始顺叶脉方向向叶片边缘进行摩擦接种，重复摩擦2-3次，摩擦力度不宜过重，使叶片产生微创即可，左右半叶用相同力度摩擦；(3)接种完15min后用洗瓶将接种叶片按接种时摩擦方向进行冲洗，冲洗时间控制在3s；(4)待叶片干后，在右半叶用移液枪加40μl，500μg/ml的宁南霉素8％，轻轻涂抹均匀，左半叶加相同体积的灭菌水做对照；(5)将处理好的的心叶烟放到温度22℃的培养箱中培养，其中湿度为75％，光照为70％，48h后观察，分别记录左右半叶的枯斑数目，并拍照记录，枯斑抑制率的公式为：其中y代表待测抗tmv药剂对心叶烟产生枯斑的抑制率，c为对照枯斑总数，a为接种叶片涂抹待测抗tmv药剂一侧的枯斑总数。结果如图3(a为接种叶片1、b为接种叶片2、c为接种叶片3、d为接种叶片4、e为接种叶片5、f为接种叶片6)，根据图3可以统计出6片接种叶上的枯斑情况如表1，根据表1统计的枯斑数量，再根据枯斑抑制率的公式，可以计算出宁南霉素8％的枯斑抑制率为51.22％。表1接种叶左右枯斑数量统计接种叶片1接种叶片2接种叶片3接种叶片4接种叶片5接种叶片6右半叶926180515244左半叶135118144134115133当前第1页12