一种提高锯齿新米虾胚胎离体培养孵化率的方法与流程

本发明属于水产养殖技术领域，尤其是一种提高锯齿新米虾胚胎离体培养孵化率的方法。

背景技术：

锯齿新米虾(neocaridinadenticulata)的个体很小，体长仅2.5厘米左右，是一种淡水虾，它的卵为大型卵，具有抱卵习性。在我国分布较为广泛，具有重要的食用和经济价值。锯齿新米虾作为一种观赏类的小型虾，在观赏市场有着非常重要的地位，锯齿新米虾属于十足目甲壳动物，世界重要经济甲壳动物都属于十足目，锯齿新米虾作为十足目的代表具有个体小、繁殖快、胚胎好操作等特性，可以用于大规模开展十足目基于胚胎操作的分子育种研究。

但是在现有的大部分锯齿新米虾养殖过程中，虾的抱卵和孵化技术不够成熟。现有的锯齿新米虾虾卵孵化以后，孵化水中细菌和寄生虫过多，容易导致虾卵死亡，给人们的养殖造成了一定的不便。

通过检索，发现如下三篇与本发明专利申请相关的公开文献：

1.中华新米虾胚胎发育的初步研究(分类号：s966.12)，包括：在水温22-26℃的室内条件下，其胚胎发育历时376小时。整个发育阶段分为：卵裂期、囊胚期、原肠期、无节幼体期ⅰ、无节幼体期ⅱ、无节幼体期ⅲ和无节幼体期ⅳ。心脏出现于无节幼体期ⅱ，并随胚胎发育而表现出心动速率明显加快。复眼出现于无节幼体期ⅲ。

2.中华锯齿米虾形态发育的初步研究(分类号：s963.21)，内容包括：从中华锯齿米虾受精卵发育开始，直到幼体破膜的过程称为胚胎发育。此过程在水温20-26℃之间经历大约15d，整个发育阶段分为：卵裂期，囊胚期、原肠期、前无节幼体期、后无节幼体期、复眼色素形成期、蚤状幼体期。

3.日本米虾胚胎发育及离体孵化(分类号：s917.4)，包括：本研究采用自制离体孵化装置,对日本米虾(caridinajaponica)不同发育期胚胎进行离体孵化研究,结果显示,水温为25.5℃时,日本米虾受精卵孵化大约需要25d,发育积温为637.5℃。胚胎发育历经受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、前无节幼体期、后无幼体期、前溞状幼体期和膜内溞状幼体期8个时期。各期离体胚胎均能孵化出幼体,膜内溞状幼体期离体胚胎孵化率最高,为(80.7±2.4)％,非离体孵化的对照组为(79.1±4.9)％,二者差异不显著；卵裂期离体胚胎孵化率最低,为(28.2±2.6)％,与对照组差异显著。各组离体胚胎所孵化出的ⅰ期(zⅰ)和ⅱ期溞状幼体(zⅱ)的变态率无显著差异。温度对日本米虾前溞状幼体期胚胎离体孵化影响显著,在15.0℃～32.5℃范围内,随水温升高孵化时间逐渐缩短,15.0℃时,前溞状幼体离体孵化时间为(436.8±124.8)h,32.5℃时缩短至(228.0±88.8)h,但温度高于29.0℃时，孵化出的幼体变态率开始下降。本研究可为日本米虾繁殖生物学及甲壳动物胚胎离体孵化技术研究提供参考。

通过对比，本发明专利申请与上述公开文献存在本质的不同。

技术实现要素：

本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种新型提高锯齿新米虾胚胎离体培养孵化率的方法，该方法摆脱了母虾抱卵孵化的限制，从而提高了锯齿新米虾胚胎离体的孵化率，为利用米虾胚胎作为十足目甲壳动物基因编辑的实验材料以及大规模定向育种提供了有效手段。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种提高锯齿新米虾胚胎离体培养孵化率的方法，步骤如下：

⑴成虾养殖水的制备：锯齿新米虾为淡水虾，所以普通的锯齿新米虾成虾用消过毒的水曝气三天以上即可放入成虾饲养；

⑵亲虾饲料的配制：其组成成分及重量份数如下：

海藻粉10-15份，小球藻10-15份，虾粉10-15份，秘鲁鱼粉10-15份，益生菌(lactococcuslactis)5-10份，甲壳素1-2份，复合矿物质1-2份，复合维生素1-2份，发酵玉米蛋白10-15份，小麦粉10-15份，菠菜10-20份；

⑶锯齿新米虾的养殖：将成虾按每m³/20尾的数量放置在养殖缸中，用配制的养殖水养殖，用配制的亲虾饲料喂养成虾，待母虾抱卵；

⑷胚胎的离体方法：将养殖成熟的健康抱卵锯齿新米虾亲虾放在消过毒的玻璃皿上，用沾湿的纱布将亲虾的头部和尾部盖住，将亲虾腹部的卵一颗颗取出，立即收集已经离体的散卵，在低浓度高锰酸钾溶液中消毒5-10秒后，立即放入容器中倒入孵化水，孵化水的量按5-10ml/卵的比例加入，密封后放入4℃冰箱中，待用；

⑸孵化的方式：将在4℃冰箱下保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞所处的时期，并做好拍照记录步骤；将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10-15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的烧杯中，倒入配制好的孵化水，孵化水的量按5-10ml/卵的比例缓缓加入，在25±1℃室温下孵化24h后重新依照上述步骤消毒换水即可。

而且，所述孵化水的制备步骤如下：

准确量取蒸馏水，分别准确称取edta、pbs缓冲液、dmem，倒入蒸馏水中，每1l蒸馏水中加入5gedta、3mlpbs缓冲液、2gdmem，0.22μm滤膜过滤灭菌，即得孵化水；密封保存，并放置室温下备用。

而且，每1lpbs缓冲液的制备如下：

称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。

而且，配置好的孵化液使用期限不超过一个月。

而且，所述低浓度高锰酸钾溶液的配制步骤如下：

称取高锰酸钾试剂，然后加入蒸馏水，每1l蒸馏水中加入0.0001g高锰酸钾试剂，混匀，密封保存，即为配置好的低浓度高锰酸钾溶液。

而且，所述步骤⑶中将亲虾腹部的卵一颗颗取出的具体操作为：

使用特制的手柄柔和地将亲虾腹部的卵一颗颗取出；

所述特制的手柄包括塑料手柄和碳纤维，所述塑料手柄沿竖直方向设置，所述碳纤维设置于塑料手柄的底端。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明方法将锯齿新米虾的受精胚胎进行离体孵化，使之前由母虾直接抱卵孵化带来的缺点减低，增加了锯齿新米虾离体培养的孵化率，提高了锯齿新米虾破膜幼体的成活率，为产业上提供了良好的应用技术。

2、本发明方法为锯齿新米虾离体受精以及胚胎操作提供了技术平台，为经济类甲壳动物的基因编辑提供必要的辅助技术。

3、近代生物技术中，杂交育种已经十分成熟，分子育种技术可以更好地提高动物植物的产量与品质。水生动物中能够开展离体胚胎培养的品种，可以成为甲壳类分子育种的备选品种。

4、本发明方法能为甲壳动物不同时期的胚胎干细胞获得提供前期必要技术。

5、本发明方法能为甲壳动物发育研究中的单细胞转录组测序蛋白组测序、代谢组测序等一些组学技术提供前期的必要技术。

6、本发明所提供的离体胚胎培育方法可以将锯齿新米虾的受精胚胎进行离体孵化，摆脱了母虾抱卵孵化的种种限制，从而提高了锯齿新米虾胚胎离体的孵化率，缩短了受精卵孵化所需的天数，也在一定程度上提高了锯齿新米虾受精卵破膜后幼体的成活率。为利用米虾胚胎作为十足目甲壳动物基因编辑的实验材料以及大规模定向育种提供了有效手段。

7、本发明方法所使用的亲虾饲料在一定程度上可以使母虾抱卵的数量增加、质量提高，并使亲虾体质有了一定程度的提高。

8、本发明方法所使用的特制手柄可使亲虾的受精卵在一颗颗被剥离的同时，免受人工外力影响的同时并且不损坏受精卵。

9、本发明方法所使用的孵化水可使受精卵在孵化的同时免受水生微生物的干扰，从而提高了本专利锯齿新米虾的离体孵化率。

10、本发明方法所描述的具体胚胎离体培养技术操作简单易上手，没有太多的条件限制。

附图说明

图1为本发明中实施例1中具体实施时的连续记录图片；其中，1受精卵期；2-6后无节幼体期；7-8前状溞幼体期；9-10膜内溞状幼体期；11破膜幼体；

图2为本发明中实施例2中平行例1具体实施时的连续记录图片；其中，1受精卵期；2-3前无节幼体期；4-5后无节幼体期；6-8前状溞幼体期；9-15膜内溞状幼体期；16破膜幼体；

图3为本发明中实施例2中平行例2具体实施时的连续记录图片；其中1.受精卵期；2.前无节幼体期；3-5.后无节幼体期；6-8.前状溞幼体期；9-14.膜内溞状幼体期；15.破膜幼体；

图4为本发明中特制的手柄的结构连接示意图。

具体实施方式

下面详细叙述本发明的实施例，需要说明的是，本实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规的市售产品；本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

一种提高锯齿新米虾胚胎离体培养孵化率的方法，步骤如下：

⑴成虾养殖水的制备：锯齿新米虾为淡水虾，所以普通的锯齿新米虾成虾用消过毒的水曝气三天以上即可放入成虾饲养；

⑵亲虾饲料的配制：其组成成分及重量份数如下：

海藻粉10-15份，小球藻10-15份，虾粉10-15份，秘鲁鱼粉10-15份，益生菌(lactococcuslactis)5-10份，甲壳素1-2份，复合矿物质1-2份，复合维生素1-2份，发酵玉米蛋白10-15份，小麦粉10-15份，菠菜10-20份；

⑶锯齿新米虾的养殖：将成虾按每m³/20尾的数量放置在养殖缸中，用配制的养殖水养殖，用配制的亲虾饲料喂养成虾，待母虾抱卵；

⑷胚胎的离体方法：将养殖成熟的健康抱卵锯齿新米虾亲虾放在消过毒的玻璃皿上，用沾湿的纱布将亲虾的头部和尾部轻轻盖住，将亲虾腹部的卵一颗颗取出，立即收集已经离体的散卵，在低浓度高锰酸钾溶液中消毒5-10秒后，立即放入容器中倒入孵化水，孵化水的量按5-10ml/卵的比例加入，密封后放入4℃冰箱中，待用；

⑸孵化的方式：将在4℃冰箱下保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞所处的时期，并做好拍照记录步骤；将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10-15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入已经消过毒的烧杯中，倒入配制好的孵化水，孵化水的量按5-10ml/卵的比例缓缓加入，在25℃左右室温下孵化24h后重新依照上述步骤消毒换水即可。

较优地，所述孵化水的制备步骤如下：

准确量取蒸馏水，分别准确称取edta、pbs缓冲液、dmem，倒入蒸馏水中，每1l蒸馏水中加入5gedta、3mlpbs缓冲液、2gdmem，0.22μm滤膜过滤灭菌，即得孵化水；密封保存，并放置室温下备用。

较优地，每1lpbs缓冲液的制备如下：

称取8gnacl、0.2gkcl、1.44gna2hpo4和0.24gkh2po4，溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液的ph值至7.4，最后加蒸馏水定容至1l。

较优地，配置好的孵化液使用期限不超过一个月。

较优地，所述低浓度高锰酸钾溶液的配制步骤如下：

称取高锰酸钾试剂，然后加入蒸馏水，每1l蒸馏水中加入0.0001g高锰酸钾试剂，混匀，密封保存，即为配置好的低浓度高锰酸钾溶液。

较优地，所述步骤⑶中将亲虾腹部的卵一颗颗取出的具体操作为：

使用特制的手柄柔和地将亲虾腹部的卵一颗颗取出；

如图4所示，所述特制的手柄包括塑料手柄1和碳纤维2，所述塑料手柄沿竖直方向设置，所述碳纤维设置于塑料手柄的底端。

更具体地，相关制备及检测如下：

一种新型的锯齿新米虾离体培养的方式，包括以下步骤：

s1.将保存的受精卵拿出，在体视镜下观察细胞正在处于的时期，拍照记录。

s2.将配好的低浓度高锰酸钾溶液倒入已灭菌的玻璃皿中，将准备孵化的受精卵放入玻璃皿的低浓度高锰酸钾溶液中静置10-15秒，然后用已消毒的塑料吸管将卵全部吸出，放入另外已经消过毒的100ml烧杯中，再倒入配制好的孵化水，并做好标记，然后放入孵化装置中。孵化水按5-10ml/卵的比例缓缓加入。

s3.24小时之后，将受精卵用塑料吸管吸出，放入已经装有一定量的低浓度高锰酸钾溶液中，静置10-15s后，将受精卵吸出。将烧杯提前用低浓度高锰酸钾溶液润洗，将吸出已消过毒的受精卵放入润洗过的烧杯中。再按上条步骤的比例倒入孵化水，继续培养。每日观察并换水一次，在体视显微镜下照片记录。

实施例1：

记录结果：(图1)

a.后无节幼体期:第1-3天。

b.前溞状幼体期:第4-5天。

c.膜内溞状幼体期:第6-9天。

d.破膜幼体:第10天。

实施例2：

平行例1：(图2)

记录结果：

a.原肠期。第1天。

b.前无节幼体期:第2天。

c.后无节幼体期:第3-4天。

d.前溞状幼体期:第5-7天。

e.膜内溞状幼体期:第8-14天。

f.破膜幼体:第15天。

平行例2：(图3)

记录结果：

a.原肠期:第1天。

b.前无节幼体期；第2-3天。

c.后无节幼体期:第4-5天。

d.前溞状幼体期:第6-8天。

e.膜内溞状幼体期:第9-13天。

f.破膜幼体:第14天。

1、使用本发明离体操作的锯齿新米虾受精卵孵化率为85％及以上，比普通的锯齿新米虾受精卵的孵化率高约5％，和其他离体孵化方法的孵化率相比也明显增加，本发明离体培养技术可在部分养殖密度更小的环境下使孵化率高达100％。

2、使用本发明的离体操作培养后的锯齿新米虾受精卵破膜天数比普通繁殖情况下的锯齿新米虾受精卵破膜天数减少了至少3-5天。

3、经本发明描述的锯齿新米虾的离体培养技术，受精卵在进行本发明的离体操作的时期越靠后，其孵化率越高，甚至高达100％。

4、本发明离体操作前分离卵所使用的特制手柄纤维柔软，可以在体视镜下轻松剥离受精卵且保证受精卵分离时不受人工外力的影响而影响后续发育。

5、使用本发明描述的锯齿新米虾离体培养技术可以防止锯齿新米虾受精卵在孵化的过程中被水生微生物感染，从而避免锯齿新米虾受精卵变成坏卵。

6、本发明描述的锯齿新米虾离体培养技术操作简单，且对周围环境的条件没有太高要求。

7、运用本发明操作的锯齿新米虾亲虾喂养饲料配方可使锯齿新米虾亲虾的抱卵数目在一定程度上增加，且使锯齿新米虾亲虾的体质增强。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。