一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法与流程

本发明属于白藜芦醇诱导富集技术领域，具体涉及一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法。

背景技术：

白藜芦醇是多酚类化合物，学名3，4，5-三羟基二苯乙烯，又称芪三酚，无色针状晶体，易溶于乙醇，乙醚，丙酮等有机溶剂。白藜芦醇具有优异的抗氧化活性，此外，白藜芦醇还具有良好的抗肿瘤活性，还可以预防心血管病、降血脂、降血压等，已在食品、保健、临床医学、化妆品等领域被广泛应用。白藜芦醇的主要药理作用机理有：白藜芦醇能有效清除机体内的羟自由基，避免dna的损伤，同时抑制二硫谷胱甘肽生成，还原状态的谷胱甘肽无法使自由基形成，达到抗氧化功效；白藜芦醇能诱导白血病细胞dna裂解，并使膜磷脂丧失不对称性,同时白藜芦醇增加癌细胞死亡依赖的cd95l的表达，使cd95和cd95l基因表达处于平衡状态，使癌细胞死亡，达到抗癌的功效。

目前，白藜芦醇主要从葡萄、花生芽、虎杖、桑葚等天然植物中提取，因此，植物原料中白藜芦醇的含量是决定白藜芦醇产量的最关键内因。现有技术，大多采用物理方法或化学方法对花生种子进行预处理，以促进花生芽中的白藜芦醇合成作用，而尚未有直接对花生芽进行诱导培养以富集白藜芦醇的相关研究。如申请号为cn201710-001010.0的专利，公开一种提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，利用浸泡液i、清水、浸泡液ⅱ依次浸泡花生种子催芽；如申请号为cn201711210304.0的专利，公开一种提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，将花生加入培养液中培养；如申请号为cn201310423792.9的专利，公开一种获得富含白藜芦醇的花生芽苗的方法，利用紫外线分别照射花生种子和采摘的花生苗芽。基于以上所述，发明人利用植物细胞悬浮培养技术和白藜芦醇诱导富集技术提供一种全新的提高花生芽中白藜芦醇含量的方法。

技术实现要素：

针对现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，包括以下步骤：

s1：制备花生芽培养液：每升600μmol/lcuso4溶液中，添加蔗糖30～35g、苯丙氨酸0.08～0.12g、灰葡萄孢菌发酵提取物0.3～1.5g、阿魏酸钠0.04～0.08g；

所述灰葡萄孢菌发酵提取物的制备方法为：28℃，将灰葡萄孢菌接种于pda液体培养基中，接种量为2×10⁴～10⁵个孢子/ml，以120～160r/min转速恒温振荡培养10～15d，超声匀浆后，加入2～2.5倍体积的85％乙醇溶液，80℃回流提取3～6h，重复1～2次，合并回流液，真空旋转蒸发回收乙醇，干燥后，即得灰葡萄孢菌发酵提取物；

s2：剪切处理：将花生芽消毒后，剪成0.8～1.2cm组织块，加入花生芽培养液中，控制固液比为2.0g:40ml，以3000～7000r/min剪切转速下处理6～24s，得花生芽培养混合悬液；

s3：紫外处理：25℃，将所得花生芽培养混合悬液置于紫外线下，辐射10～30min；

s4：悬浮培养：25℃，在避光黑暗条件下，以100～120r/min转速将紫外处理后花生芽培养混合悬液恒温振荡培养16～40h。

优选的是，所述花生芽消毒方法为：用0.5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒花生芽15～30min，再用去离子水反复冲洗3遍。

优选的是，所述紫外线的辐射强度为150μw/cm²。

本发明的有益效果：

1、本发明以花生芽为诱导对象，结合植物细胞悬浮培养技术和白藜芦醇富集技术，首次实现在花生芽组织块培养过程中诱导白藜芦醇的合成，先采用剪切处理、紫外处理等手段对花生芽进行物理联合诱导，剪切处理有助于花生芽中的白藜芦醇分泌到细胞外，紫外线辐射提高了苯胺裂解酶活性，促进内源性白藜芦醇和黄酮类等次生代谢产物的生成，并在花生芽培养液进行悬浮培养，实现对白藜芦醇的生物及化学诱导富集，培养液中灰葡萄孢菌发酵提取物刺激白藜芦醇合成酶(rs)基因的表达，提高白藜芦醇合成酶活性，花生芽培养液中cu²⁺和苯丙氨酸造成了一定的化学胁迫环境，提高苯丙氨酸解氨酶的活性，阿魏酸钠为天然抗氧化剂，避免花生芽愈伤组织块氧化褐变，同时，阿魏酸也是植物细胞壁的重要成分，有助于促进花生芽组织细胞的增殖，并提高细胞活力。

2、相比于从花生芽中直接提取白藜芦醇的传统方法，本发明显著提高了白藜芦醇产量，达到851μg/g以上，增长率达到280％以上。

附图说明

图1为本发明利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法；

图2为白藜芦醇质量浓度与吸光度值关系的标准曲线。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例1～3所用灰葡萄孢菌发酵提取物的制备方法为：28℃，将灰葡萄孢菌接种于pda液体培养基中，接种量为5×10⁴个孢子/ml，以150r/min转速恒温振荡培养10d，超声匀浆后，加入2倍体积的85％乙醇溶液，80℃回流提取6h，重复2次，合并回流液，真空旋转蒸发回收乙醇，干燥后，即得灰葡萄孢菌发酵提取物。

实施例1

一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，包括以下步骤：

s1：制备花生芽培养液：每升600μmol/lcuso4溶液中，添加蔗糖30g、苯丙氨酸0.08g、灰葡萄孢菌发酵提取物0.3g、阿魏酸钠0.04g；

s2：剪切处理：用0.5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒花生芽30min，再用去离子水反复冲洗3遍后，将2.0g已消毒花生芽剪成1.0cm，加入40ml花生芽培养液中，以3000r/min剪切转速下处理6s，得花生芽培养混合悬液；

s3：紫外处理：25℃，将所得花生芽培养混合悬液置于辐射强度为150μw/cm²的紫外线下，辐射10min；

s4：悬浮培养：25℃，在避光黑暗条件下，以100r/min转速将紫外处理后花生芽培养混合悬液恒温振荡培养16h。

实施例2

一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，包括以下步骤：

s1：制备花生芽培养液：每升600μmol/lcuso4溶液中，添加蔗糖30g、苯丙氨酸0.1g、灰葡萄孢菌发酵提取物0.3～1.5g、阿魏酸钠0.06g；

s2：剪切处理：用0.5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒花生芽30min，再用去离子水反复冲洗3遍后，将2.0g已消毒花生芽剪成1.0cm，加入40ml花生芽培养液中，以4000r/min剪切转速下处理12s，得花生芽培养混合悬液；

s3：紫外处理：25℃，将所得花生芽培养混合悬液置于辐射强度为150μw/cm²的紫外线下，辐射10min；

s4：悬浮培养：25℃，在避光黑暗条件下，以100r/min转速将紫外处理后花生芽培养混合悬液恒温振荡培养20h。

实施例3

一种利用细胞悬浮培养技术提高花生芽中白藜芦醇含量的方法，包括以下步骤：

s1：制备花生芽培养液：每升600μmol/lcuso4溶液中，添加蔗糖35g、苯丙氨酸0.12g、灰葡萄孢菌发酵提取物1.5g、阿魏酸钠0.08g；

s2：剪切处理：用0.5％的次氯酸钠溶液浸泡消毒花生芽30min，再用去离子水反复冲洗3遍后，将2.0g已消毒花生芽剪成1.0cm，加入40ml花生芽培养液中，以7000r/min剪切转速下处理24s，得花生芽培养混合悬液；

s3：紫外处理：25℃，将所得花生芽培养混合悬液置于辐射强度为150μw/cm²的紫外线下，辐射14min；

s4：悬浮培养：25℃，在避光黑暗条件下，以120r/min转速将紫外处理后花生芽培养混合悬液恒温振荡培养32h。

对比例1为空白对照组：将2.0g未作组织块细胞悬浮培养的原始花生芽剪成1.0cm，加入40ml去离子水。

对比例2与实施例1相同，区别在于：以等量去离子水代替花生芽培养液中的600μmol/lcuso4溶液。

对比例3与实施例1相同，区别在于：花生芽培养液中不含灰葡萄孢菌发酵提取物。

对比例4与实施例1相同，区别在于：花生芽培养液中不含苯丙氨酸。

对比例5与实施例1相同，区别在于：无紫外处理操作。

制作白藜芦醇标准曲线

准确称取白藜芦醇对照品10.0mg，在50ml容量瓶中添加白藜芦醇对照品后用甲醇定容，稀释摇匀，再取3ml于25ml容量瓶中用甲醇定容，分别吸取对照液0、1、2、3、4，5ml，分别置于25ml容量瓶中并用甲醇定容，然后分别测其在306nm处的吸光值，测定3次，求平均值，绘制标准曲线，如图2所示。

用10000r/min高速匀浆机破碎实施例1～3、对比例1～5处理后混合悬液1min，60℃水浴条件下，分别加入120ml乙醇浸提2h，再以4000r/min转速离心10min，最后使用紫外分光光度计在306nm波长下测定白藜芦醇的吸光度，通过公式计算白藜芦醇产量：w＝(c×v)/m，式中：w为材料中白藜芦醇的产量(μg/g)，m为花生芽的质量(g)，v试验后提取液稀释后的体积(ml)，c为根据标准曲线方程得来的白藜芦醇的质量浓度(g/ml)。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。