一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法与流程

本发明涉及植物组织培养与快速繁殖领域，具体来说，特别是一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法。

背景技术：

黄精(polygonatumsibiricumred)为百合科黄精属多年生药用植物，性甘、味平，归脾、肺、肾经，以干燥根状茎入药。具有补气养阴、健脾、润肺、益肾之功效，主治脾胃气虚、胃阴不足、肺虚燥咳、精血不足、须发早白、内热消渴等，黄精是传统补益类中药，集药用、食用、观赏和保健于一身。其含有黏液质、淀粉、糖类、蒽醌类化合物，以及多种氨基酸和维生素等成分，在保健行业迅速发展起来。现代医学研究发现黄精中含有甾体皂苷类、木脂素类、黄酮类、生物碱盐类等化合物，对治疗高血糖、血脂，抑菌、抗炎、抗病毒效果显著，同时，黄精多糖的存在对抗肿瘤有一定的作用。

黄精在自然情况下有性繁殖率低，种子具有一定的休眠作用，在长期的演化过程中形成了营养繁殖。近年来随着市场需求不断增大，野生资源不断萎缩，加上生态环境恶化和人为掠夺式采挖，野生资源日近枯竭，不能满足市场需求。目前，人工栽培主要采用分株繁殖和有性繁殖，营养器官繁殖受资源和繁殖系数的限制，加之种性退化繁殖系数逐渐下降，种子繁殖在一定程度提高了繁殖系数，但依然无法满足规模化生产。为了满足市场需求，更好地保护黄精野生资源，研究其有效的繁殖技术迫在眉睫。

技术实现要素：

本发明的目的在于，提供一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法。本发明具有能够有效地提高黄精的繁殖系数，缩短其生长周期，为实现其工厂化育苗与药材规模化生产奠定了基础的特点。

本发明的技术方案：一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法，以黄精种子无菌萌发后获得的初生根状茎为外植体材料，然后通过组织培养诱导获得带白色组织，经进一步诱导形成丛生芽，再通过分化培养形成无根苗，最后以无根苗培养生产大量黄精试管苗，经炼苗、移栽，获得生长健壮的黄精植株，具体包括以下步骤：

步骤1：采至野外的黄精种子经处理消毒后播种于以棉花为支撑物的培养瓶中置于暗室培养，萌发获得初生根状茎作为诱导丛生芽的外植体；

步骤2：将步骤1中的初生根状茎外植体接种于的培养基中，ph＝5.7-5.9，置于22±3℃、光照强度1900-2100lx、光照时间11-13h/d的光照培养箱内进行培养，培养15d后初生根状茎增大，颜色由白色变为绿色，同时在初生根状茎的基部形成一圈白色的组织，得生长健壮白色组织明显的初生根状茎；

步骤3：将步骤2中的生长健壮白色组织明显的初生根状茎接种于的培养基中培养，ph＝5.7-5.9，其它培养条件与步骤2相同，20d后诱导形成丛生芽；

步骤4：将步骤3中的丛生芽块切开，带有芽点的组织接种于培养基中，进一步分化诱导，15d后形成具有两片叶子的黄精无根苗；

步骤5：将步骤4中的黄精无根苗接种于培养基中进行壮苗生根培养，30d后获得健壮的黄精试管苗；

步骤6：将步骤5中的黄精试管苗转至炼苗室，3-5d后，开盖取出幼苗，洗净根上附着的培养基，晾干至根开始泛白，然后用750-850倍多菌灵溶液浸泡其根25-35min，移栽到苗床上，喷水保湿，1个月后移栽上盆，即获得生长健壮的黄精植株。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤1中，采至野外的黄精种子经处理消毒是将黄精种子处理先超声30min，添加150mg/lga3于40℃的水浴锅中水浴加热2h。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤2中，将步骤1中的初生根状茎外植体接种于ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l+ga30.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.5g/l的培养基中，ph＝5.8。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤2中，置于22±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d的光照培养箱内进行培养。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤3中，步骤2中的生长健壮白色组织明显的初生根状茎接种于ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.5g/l的培养基中培养。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤4中，将步骤3中的丛生芽块切开，带有芽点的组织接种于ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5g/l培养基中。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤5中，选取步骤4中长势良好的黄精无根苗，接种于1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa1.0mg/l+iaa0.6mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+活性炭1.0g/l的培养基中进行壮苗生根培养。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤5中，30d后形成3-5条长为2-4cm根的健壮黄精试管苗。

前述的黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法中，所述步骤6中，用800倍多菌灵溶液浸泡其根30min。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

由于黄精种子存在休眠，萌发时间长，营养繁殖种性退化、病虫害严重、生长周期长、繁殖系数低等问题，无法满足市场需求。本发明通过初生根状茎诱导丛生芽，在短时间内培育出大量生长健壮可供移栽的黄精试管苗，为实现黄精工厂化育苗与规模化生产奠定了基础。

发明人进行了大量的实验，以下是部分实验研究

实验例1：丛生芽诱导

本发明中的植物材料黄精(polygonatumsibiricumred)采自贵州省石阡县，将种子经无菌萌发后获得初生根状茎。

将种子萌发形成的初生根状茎作为外植体，接种于ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l+ga30.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.5g/l培养基中培养，培养周期为40d，每个1周观察记录一次生长状况，约15d后原球茎颜色由白色转为黄绿色，同时在初生根状茎的基部形成一圈白色的组织，30d后初生根根状茎基部膨大明显，转移至培养基ms+6-ba3.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.5g/l中继续培养，40d后形成丛生芽。

实验例2：丛生芽分化培养

选取实验例1中生长势较好的丛生芽分割后，接种于添加不同种类及浓度的植物生长调节物质、不同蔗糖浓度的培养基中，采用6-ba、naa、蔗糖3因素3水平正交试验，培养条件同实验例1。30d后统计分化率(其中，丛生芽的分化率＝(分化的外植体数/接种前总的外植体数)×100，考查不同处理对丛生芽分化的影响。结论：丛生芽分化培养基以ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5g/l效果较好(表1)，在该培养基中丛生芽分化程度高，且分化形成的无根苗健壮，长势好。

表1不同处理组合黄精丛生芽分化的影响

注：表中不同大写字母表示两者具有极显著差异(p<0.01)，下同。

实验例3：壮苗生根培养

将实验例2中诱导形成的无根苗分割成单一植株，未分化部分继续接种于实验例2中的培养基上分化，分割好的无根苗接种于以1/2ms为基本培养基，附加活性炭1.0g/l，添加不同种类及浓度的生长调节物质中，以6-ba、naa、iaa为试验因子，设置三因素三水平正交试验，培养条件同实验例1。30d后统生根率(其中，生根率(％)＝(生根了的的组培苗数/接种苗数)×100，考查不同处理对黄精无根苗生根的影响。结论：壮苗生根培养基以1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa1.0mg/l+iaa0.6mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+活性炭1.0g/l效果较好(表2)，在该培养基中生根率高，且形成的试管苗健壮，长势好。

表2不同处理组合黄精无根苗生根的影响

实验例4：炼苗移栽

将实验例3中生长健壮的黄精试管苗转至炼苗室，3-5d后，开盖取出幼苗，洗净根上附着的培养基，晾干至根开始泛白，然后用800倍多菌灵溶液浸泡其根30min，移栽到苗床上，喷水保湿，1个月后移栽上盆，即获得生长健壮的黄精植株。

综上所述，本发明较好地解决了黄精种苗繁殖系数低、种性退化、生长缓慢、生产周期长等问题，本发明具有能够有效地提高黄精的繁殖系数，缩短其生长周期，为实现其工厂化育苗与药材规模化生产奠定了基础的有益效果。

附图说明

图1是本发明黄精形成试管苗的过程；其中a：初生根状茎；b：丛生芽；c：分化形成的无根苗；d：生根的试管苗。

具体实施方式

下面结合附图和实验例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实验例1。一种黄精丛生芽诱导与试管苗形成的方法，黄精形成试管苗的过程如图1所示，其中a：初生根状茎；b：丛生芽；c：分化形成的无根苗；d：生根的试管苗，具体包括以下步骤：

步骤1：采至野外的黄精种子经处理消毒后播种于以棉花为支撑物的培养瓶中置于暗室培养，萌发获得初生根状茎作为诱导丛生芽的外植体；所述采至野外的黄精种子经处理消毒是将黄精种子处理先超声30min，添加150mg/lga3于40℃的水浴锅中水浴加热2h；

步骤2：将步骤1中的初生根状茎外植体接种于ms+6-ba4.0mg/l+naa0.2mg/l+ga30.5mg/l+蔗糖30g/l+琼脂4.5g/l的培养基中，ph＝5.8，置于22±2℃、光照强度2000lx、光照时间12h/d的光照培养箱内进行培养，培养15d后初生根状茎增大，颜色由白色变为绿色，同时在初生根状茎的基部形成一圈白色的组织，得生长健壮白色组织明显的初生根状茎；

步骤3：将步骤3中的丛生芽块切开，带有芽点的组织接种于ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5g/l培养基中，ph＝5.7-5.9，其它培养条件与步骤2相同，20d后诱导形成丛生芽；

步骤4：将步骤3中的丛生芽块切开，带有芽点的组织接种于ms+6-ba1.0mg/l+naa0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂5g/l培养基中，进一步分化诱导，15d后形成具有两片叶子的黄精无根苗；

步骤5：选取步骤4中长势良好的黄精无根苗，接种于1/2ms+6-ba0.2mg/l+naa1.0mg/l+iaa0.6mg/l+蔗糖30g/l+琼脂6g/l+活性炭1.0g/l的培养基中进行壮苗生根培养，30d后形成3-5条长为2-4cm根的健壮黄精试管苗；

步骤6：将步骤5中的黄精试管苗转至炼苗室，3-5d后，开盖取出幼苗，洗净根上附着的培养基，晾干至根开始泛白，然后用800倍多菌灵溶液浸泡其根30min，移栽到苗床上，喷水保湿，1个月后移栽上盆，即获得生长健壮的黄精植株。