一种利用弗氏假丝酵母菌促进冬虫夏草子实体生长的人工栽培方法与流程

技术领域：

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种弗氏假丝酵母菌促进冬虫夏草子实体生长的人工栽培方法。

背景技术：
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冬虫夏草是我国最具特色的生物资源，是冬虫夏草菌(ophiocordycepssinensis)感染寄主昆虫蝙蝠蛾幼虫，使其僵化，在适宜条件下感菌僵虫生长，形成具有虫(僵虫)草(真菌子实体)复合形态的结构。冬虫夏草菌隶属子囊菌门(ascomycota)、粪壳菌纲(sordariomycetes)、肉座菌目(hypocreales)、线虫草科(ophiocordycipitaceae)、虫草属(ophiocordyceps)。冬虫夏草在我国主要产于西藏、青海、云南、四川、甘肃等海拔3000米以上的雪山高寒山区。冬虫夏草是我国药食同源佳品，具有“补肺、强肾、益精气、理诸虚百损”等众多功效。现代医学证明冬虫夏草具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗辐射及免疫调节等功能，在医药、食品以及现代生物技术等方面具有广泛的应用。

资源的枯竭、需求的旺盛和政策的保护导致其市场价格飞涨。野生冬虫夏草已被列为国家二级保护物种。为了保护青藏高原生态、虫草资源，让冬虫夏草更好地为人类健康服务，唯一选择是人工培育。

目前，于人工培养基中已成功培养冬虫夏草子实体。朱新燕等(2013)(专利申请号为201310432723.4，发明名称为：一种冬虫夏草子实体及其培植方法)虽然其能够培养出冬虫夏草子实体，但是其具有以下三个缺点：1、其诱导子实体至子实体长出需要在低氧浓度(10-15％氧气浓度)下，如果在低海拔地区，维持低氧浓度长达5-6个月的话，其成本是非常可观的；2、其诱导子实体至子实体长出需要长达5-6个月的时间，时间比较长；3、其培养基的成本比较高，不适合商业化大规模培养。曹莉等(2014)发明了一种冬虫夏草子实体人工栽培方法，将冬虫夏草菌接种到无菌的大米培养基中，置于9-13℃下培养40-60天，待菌丝长满培养基后，1-8℃下低温诱导60-80天即可长出子实体原基，转至11-16℃下培养至收获子实体；该发明提供的方法无需低氧环境，可降低培养成本；从诱导到收获子实体只需3-4个月；使用的大米培养基成本低廉，适合于冬虫夏草子实体商业化栽培(专利申请号为201410289703.0，发明名称：一种冬虫夏草子实体人工栽培方法)。

技术实现要素：
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本发明的目的是提供一种于栽培培养基中添加冬虫夏草伴生菌-弗氏假丝酵母菌cd-19，促进在低海拔地区正常氧浓度下促进冬虫夏草子实体生长的人工栽培方法。

本发明的利用弗氏假丝酵母菌(candidafriedrichii)促进冬虫夏草子实体生长的人工栽培方法，其特征在于，用含弗氏假丝酵母菌、或其培养液，或其培养液的上清液的冬虫夏草菌(ophiocordycepssinensis)的栽培培养基对冬虫夏草菌进行培养。

优选，所述的弗氏假丝酵母菌为弗氏假丝酵母菌cd-19，其保藏编号为：gdmccno.60980。

优选，是在冬虫夏草菌的栽培培养基中加入冬虫夏草菌，然后再接入弗氏假丝酵母菌、或其培养液，或其培养液的上清液，进行培养；

或者是在冬虫夏草菌的栽培培养基中接入弗氏假丝酵母菌、或其培养液，或其培养液的上清液，然后再加入冬虫夏草菌，进行培养。

所述的弗氏假丝酵母菌培养液是用lb培养基培养弗氏假丝酵母菌，获得的培养液。

所述的弗氏假丝酵母菌培养液的上清液是用lb培养基培养弗氏假丝酵母菌，获得的培养液，然后再离心分离菌体和上清液，获得上清液。

所述的弗氏假丝酵母菌培养液是通过以下方法制备的：

(1)弗氏假丝酵母菌母种的制备：将弗氏假丝酵母菌接入pda固体培养基中，28℃下培养24小时，选取单个菌落作为母种；

(2)弗氏假丝酵母菌培养液的制备：将母种菌落接至液体pda中，28℃下，120rpm摇床振荡培养至od值为1.0-3.0，获得弗氏假丝酵母菌培养液。

优选，包括以下步骤：

(1)母种制备：将冬虫夏草菌接入固体ppda培养基中，9-16℃下培养45-60天后，选取冬虫夏草菌落作为母种；

(2)液体菌种制备：将母种菌落接至液体ppda培养基中，9-16℃下，振荡培养40-60天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3mm的作为液体菌种；在无菌环境下，用无菌水稀释液体菌种5-10倍，接入到无菌的栽培培养基上；

(3)再在栽培培养基中加入弗氏假丝酵母菌、或其培养液，或其培养液的上清液，然后进行培养。

所述的栽培培养基是由大米和营养液按重量比1:1混合而成，所述的营养液每升含有葡萄糖20g，kh2po42g，mgso41g，柠檬酸铵1g，蛋白胨5g，蚕蛹粉2g，余量为水，ph值6.0-6.5。

本发明的第二个目的是提供一种弗氏假丝酵母菌(candidafriedrichii)cd-19，分离自天然的冬虫夏草和冬虫夏草寄主昆虫-蝙蝠蛾幼虫肠道中的伴生菌-弗氏假丝酵母菌cd-19，其于2020年03月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为：gdmccno.60980。

本发明的第三个目的是提供上述弗氏假丝酵母cd-19在促进冬虫夏草菌子实体生长中的应用。

本发明的固体ppda培养基是现有技术中常用的培养基，其配方为：葡萄糖20g，马铃薯200g，蛋白胨10g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，vb10.02g，琼脂15g，h2o1000ml，自然ph，其配制方法为：将马铃薯洗净去皮，加水煮烂，再用纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖、蛋白胨，kh2po4，mgso4·7h2o，vb1，琼脂，用水定容至1l，121℃灭菌30分钟备用。所述的液体ppda培养基是指将固体ppda培养基中的琼脂去掉后得到的培养基，其配制方法同上，只是不加琼脂。

本发明的冬虫夏草子实体人工栽培方法，相比未加伴生菌的对照，在添加伴生菌或伴生菌稀释10倍上清液的培养基中，冬虫夏草菌原基分化早至少52天，子实体条数多(稀释10倍上清平均多7.22条，加入菌体平均多6.25条)、产量高(干重分别增产255％、290％)，缩短了培养时间至少58天，因此可大大降低培养成本。

candidafriedrichiicd-19于2020年03月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为：gdmccno.60980。

附图说明：

图1是添加伴生菌菌体培养的冬虫夏草子实体；

图2是未添加伴生菌培养的冬虫夏草子实体；

图3是添加伴生菌上清液培养的冬虫夏草子实体；

图4是未添加伴生菌培养的冬虫夏草子实体。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的弗氏假丝酵母菌cd-19，是分离自天然的冬虫夏草和冬虫夏草寄主昆虫-蝙蝠蛾幼虫肠道中的伴生菌-弗氏假丝酵母菌cd-19，在pda平板上菌落小、呈米白色、凸起边缘光滑。用真菌dna提取试剂盒(hipurefungaldnaminikitii(magen)提取基因组dna，用its4(tcctccgcttattgatatgc)和its5(ggaagtaaaagtcgtaacaagg)为引物扩增得到的产物经测序得到的序列在ncbi库中比对为弗氏假丝酵母菌，序列如seqidno.1所示，是弗氏假丝酵母菌，命名为：弗氏假丝酵母菌(candidafriedrichii)cd-19，于2020年03月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，地址：广东省广州市越秀区先烈中路100号，保藏编号为：gdmccno.60980。

1、弗氏假丝酵母菌cd-19菌体的制备：

(1)弗氏假丝酵母菌母种的制备：将弗氏假丝酵母菌cd-19接入pda固体培养基上，28℃下培养24小时，选取单个菌落作为母种；

(2)液体菌种制备：将母种菌落接至液体pda中，28℃下，120rpm摇床振荡培养至od值为2.6(约24小时)，备用，得到弗氏假丝酵母cd-19菌液。

2、固体ppda培养基是现有技术中常用的培养基，其配方为：葡萄糖20g，马铃薯200g，蛋白胨10g，kh2po43g，mgso4·7h2o1.5g，vb10.02g，琼脂15g，h2o1000ml，自然ph，其配制方法为：将马铃薯洗净去皮，加水煮烂，再用纱布过滤，在滤液中加入葡萄糖、蛋白胨，kh2po4，mgso4·7h2o，vb1，琼脂，用水定容至1l，121℃灭菌30分钟备用。所述的液体ppda培养基是指将固体ppda培养基中的琼脂去掉后得到的培养基，其配制方法同上，只是不加琼脂。

实施例1：

实验地点：位于广州市的广东省生物资源应用研究所实验室，下述培养都是在空气的常规氧浓度下。

将冬虫夏草菌种接入无菌固体ppda培养基中，在9℃暗培养60天后，选取冬虫夏草菌菌落作为母种；将母种菌落接至无菌液体ppda培养基中，在9℃下，100rpm摇床振荡培养60天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3毫米的作为液体菌种，用于冬虫夏草的栽培生产。在超净工作台中，将12.5ml用无菌水稀释10倍的液体菌种接入到含100ml的无菌的栽培培养基的培养瓶中。将接种后的培养瓶置于9-13℃下培养60天，待菌丝长满培养基后，在42个培养瓶中每个培养瓶中加入0.5ml重悬后的菌体(以添加同样体积的pbs到培养瓶的作为对照，对照也为42瓶)，置于4℃下低温诱导平均120天即可长出子实体原基，90天后便可收获长度达到4-8cm的子实体，即从低温诱导到长出能够收获的子实体的时间为210天。与未加入伴生菌(弗氏假丝酵母菌)的对照培养瓶相比，加入伴生菌的培养瓶冬虫夏草原基分化的时间平均提前52天，子实体收获时间平均提前58天，子实体干重平均增加255％，子实体平均多6.25条。人工栽培的冬虫夏草子实体如图1所示。该冬虫夏草子实体在形态上与野生冬虫夏草的子实体一致，可作为食品应用。而未添加伴生菌培养的对照冬虫夏草子实体如图2所示。

所述的重悬后的菌体是将od值为2.6的弗氏假丝酵母cd-19菌液用离心机离心10min，离心转速8000rpm，在超净工作台中，去除上清液，收集菌体。按45ml的弗氏假丝酵母cd-19菌液离心后收集的菌体用30ml的pbs重悬，获得重悬后的菌体。

所述的栽培培养基的配制方法：将葡萄糖20g，kh2po42g，mgso41g，柠檬酸铵1g，蛋白胨5g，蚕蛹粉2g，溶于少量水中，ph值6.0-6.5，再定容至1l，得到营养液。将大米和营养液按重量比1:1混合搅拌后，装于培养瓶中，121℃灭菌60分钟备用。

实施例2：

实验地点：位于广州市的广东省生物资源应用研究所实验室，下述培养都是在空气的常规氧浓度下。

将冬虫夏草菌种接入无菌固体ppda培养基中，在9℃暗培养60天后，选取冬虫夏草菌菌落作为母种；将母种菌落接至无菌液体ppda培养基中，在9℃下，100rpm摇床振荡培养60天，选取菌丝球大小均匀一致、直径为2-3mm的作为液体菌种，用于冬虫夏草的栽培生产。

在超净工作台中，将12.5ml用无菌水稀释5倍的液体菌种接入到含100ml的无菌的栽培培养基的培养瓶中。将接种后的培养瓶置于9-13℃下培养60天，待菌丝长满培养基后，将弗氏假丝酵母菌上清液用pbs稀释10倍后，42个培养瓶，每个培养瓶中加入稀释10倍的上清液0.5ml(以添加同样体积的pbs到培养瓶的作为对照，对照也为42瓶)，置于4℃下低温诱导，大概平均115天即可长出子实体原基，90天便可收获长度达到4-8cm的子实体，即从低温诱导到长出能够收获的子实体的时间平均为205天。与未加入弗氏假丝酵母菌上清液的对照培养瓶相比，加入伴生菌上清液的培养瓶冬虫夏草原基分化的时间平均提前65天，子实体收获时间平均提前65天，子实体干重平均增加290％，子实体平均多7.22条。人工栽培的冬虫夏草子实体如图3所示。该冬虫夏草子实体在形态上与野生冬虫夏草的子实体相似，可作为食品应用。而未添加伴生菌上清液培养的对照冬虫夏草子实体如图4所示。

所述的弗氏假丝酵母菌上清液是将od值为2.6的弗氏假丝酵母cd-19菌液用离心机离心10min，离心转速8000rpm，在超净工作台中，吸取上清液，获得弗氏假丝酵母菌上清液。

所述的栽培培养基的配制方法：将葡萄糖20g，kh2po42g，mgso41g，柠檬酸铵1g，蛋白胨5g，蚕蛹粉2g，溶于少量水中，ph值6.0-6.5，再定容至1l，得到营养液。将大米和营养液按重量比1:1混合搅拌后，装于培养瓶中，121℃灭菌60分钟备用。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>广东省生物资源应用研究所

<120>一种利用弗氏假丝酵母菌促进冬虫夏草子实体生长的人工栽培方法

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>664

<212>dna

<213>弗氏假丝酵母菌cd-19(candidafriedrichii)

<400>1

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