一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法与流程

本发明属于植物新品种技术领域，具体涉及一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法。

背景技术：

牛尾菜(smilaxripariaa.dc.)是百合科菝葜属多年生草质藤本植物。别名：鞭鞘子菜、草菝葜、鞭杆菜、千层塔、龙须菜，茎长1-2米，中空，有少量髓，干后凹瘪并具槽。叶比上种厚，形状变化较大；叶柄长7-20毫米，通常在中部以下有卷须。伞形花序总花梗较纤细，长3-5(-10)厘米。主要分布于中国东北、朝鲜和日本等地区，生长于海拔1600米以下的林下、灌丛、山沟或山坡草丛中。牛尾菜是一种集食用、药用和工业用为一体的野生资源植物，具有重要的经济价值。牛尾菜的根状茎具有甘、苦、平的特性，具有祛痰、止咳、通络止痛、活血化瘀之功效，可用于腰腿筋骨疼痛，跌打损伤；主治风湿性关节炎、筋骨疼痛、腰肌劳损等，也是东北地区多种植物资源中值得进一步筛选的抗癌植物种类之一。牛尾菜作为工业原料，利用其种子可提取油料，其根茎还富含鞣质，可提取栲胶，这些都是工业上的重要原材料。牛尾菜可以作为野菜食用，是人们喜食的野菜珍品，其营养价值高，且纤维柔软可口，茎口味清香，其嫩茎叶中总氨基酸含量为215.95毫克/克，远远超过一般蔬菜，甚至高于名贵的山野菜白芦笋、蕨菜等，在17种氨基酸中有7种人体必需的氨基酸，占总氨基酸含量的32.65％；嫩茎叶中还含有丰富的钙、锌、铁、维生素类及含氮物质，特别是b族维生素，堪称维生素含量特高的野菜。

目前，作为食材和药用的牛尾菜来源于野生资源，由于过度采挖，野生资源濒临灭绝。吉林和辽宁部分地区已对牛尾菜进行人工驯化和栽培生产，仍在小范围摸索阶段，尚未实现大面积人工栽培。人工栽培生产过程中产量较低，亩产不足500斤，出现萌芽力差、茎干细弱、易老化、植株退化严重、产量低和抗性差等问题，且地下根茎有腐烂，并趋于严重的现象。

在现有技术中，对牛尾菜的研究大多集中于种子苗人工繁育、驯化和栽培生产技术及病虫害防治等方面，未发现进行品种改良和新品种(系)培育的相关报道，而且因其市场供不应求严重和野生种栽培问题之间存在的矛盾性问题。因此，急需栽培出性状优良、遗传稳定且抗性强的牛尾菜新品种(系)，并应用于人工规模化生产栽培。

技术实现要素：

为了解决上述牛尾菜野生资源濒临灭绝，人工栽培产量较低，易出现萌芽力差、茎干细弱、易老化、植株退化严重、产量低、抗性差等问题，本发明提供一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

(1)材料选择与预处理：6月中下旬，待野生牛尾菜伞形花序放开后选取总花柄，切取3.0cm长度；接着用75％乙醇涮洗10s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗8次，并用无菌滤纸吸干表面水分；接着在超净工作台内，将消毒灭菌后的花柄纵向切开，切割成1.0cm的小段形成花柄组织，将花柄组织分批放入不同浓度的ems溶液中，浸泡20-60min；最后用无菌水冲花柄组织15次，以备接种；

(2)花柄组织不定芽的诱导培养：将步骤(1)中经过ems浸泡后的花柄组织转接到花柄组织不定芽诱导培养基中，并置于光照周期8h·d^-1、光照强度900lx和温度28±2℃条件下培养72天，花柄组织上部茎皮上产生独立、可分离的不定芽，并继续培养20天，不定芽长至0.8cm；

(3)不定芽生根复壮培养：将步骤(2)中不定芽长至0.8cm时，将不定芽剥离转接到不定芽生根复壮培养基中进行生根复壮培养，同时置于光照周期10h·d^-1、光照强度1300lx和温度26±2℃条件下培养35天，不定芽完全生长发育成含有根和茎叶的小植株；

(4)移栽和定植及品系确定：当步骤(3)中小植株在培养瓶中长至3.0cm时，从瓶中取出经驯化炼苗后栽植于营养钵中，待长至50cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况，并进行分类及注标签；接着将差异植株进行组培快繁，组培快繁后栽培于不同适宜地域；最后进行筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号。

进一步的，步骤(1)中ems以浓度为0.1mol·l^-1、ph＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.05-0.19％的ems溶液。

进一步的，不同浓度的ems溶液分别为体积百分比0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％的ems溶液。

进一步的，不同浓度的ems溶液分别对应的浸泡时间为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min。

进一步的，培养基包括基本培养基，所述基本培养基的成份包括下列物质：马铃薯上清液50g·l^-1；大量元素：25.0mg·l^-1nh4no3，9.0mg·l^-1cacl2·2h2o，10.5mg·l^-1mgso4·7h2o；铁盐：3.2mg·l^-1feso4·7h2o，2.1mg·l^-1na2·edta·2h2o。

进一步的，步骤(2)中培养基为基本培养基附加3.5mg·l^-1氯吡苯脲和1.0mg·l^-1kt，以及6.7g·l^-1琼脂粉，40g·l^-1蔗糖。

进一步的，步骤(2)中培养基的ph值为6.2。

进一步的，步骤(3)中培养基为基本培养基附加0.05mg·l^-1iaa，以及6.8g·l^-1琼脂粉，15g·l^-1蔗糖。

进一步的，步骤(3)中培养基的ph值为6.0。

进一步的，突变体分类根据突变体长势、茎、株型形态特征中的一种或多种进行差别分类；所述品系确定根据突变体长势、形态特性、萌芽力、茎干强弱、植株老化和退化情况、产量、抗性、种子苗遗传情况中的一种或多种因素进行筛选。

本发明提供一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法，具有以下有益效果：

(1)甲基磺酸乙酯(ems)的特性是作用于诱发点，使诱发点突变，不会导致染色体畸形，显性突变高，无需进一步遗传转化，可直接获得遗传稳定突变体，栽培多态性极小，可直接选择优良性状突变体作为品系栽培和品种审定，显著缩短了育种周期；

(2)本方法简捷多效、诱导后代突变率高、变异范围广、突变体遗传稳定性好、突变具有多样性等优点；

(3)本方法以牛尾菜花柄组织为材料，应用甲基磺酸乙酯与植物组织培养技术相结合的方法，经过花柄组织不定芽诱导、不定芽生根复壮等途径获得遗传稳定突变体，该突变体具有各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特点，并可进一步应用于牛尾菜突变体库的构建和和品种培育。

附图说明

图1为牛尾菜花柄组织诱导的不定芽结构图；

图2中a.优良性状品系(品系代码：2015-019)春季芽萌发状态图；

b.野生牛尾菜春季芽萌发状态图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1和2所示，一种诱导牛尾菜花柄组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

1材料与方法

1.1材料选取与预处理

6月中下旬，待野生牛尾菜伞形花序放开后选取总花柄，切留3.0cm长度后用75％乙醇(体积百分比浓度)涮洗10s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡3min，无菌水冲洗8次，无菌滤纸吸干表面水分备用。

1.2方法

1.2.1甲基磺酸乙酯(ems)溶液配制

ems以浓度为0.1mol·l^-1、ph＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.05-0.19％的ems溶液；

即以ph7.0的0.1mol·l^-1的磷酸盐缓冲液作为溶剂，将甲基磺酸乙酯(ems)配制成体积百分比浓度(v·v^-1)溶液，浓度分别为0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％，以及磷酸盐缓冲液作为对照液(ck)，该浓度范围依据花柄组织死亡率经预实验获得，使用前需过滤灭菌消毒。

1.2.2培养基配制

基本培养基成份和用量为：马铃薯上清液50g·l^-1；大量元素：25.0mg·l^-1nh4no3，9.0mg·l^-1cacl2·2h2o，10.5mg·l^-1mgso4·7h2o；铁盐：3.2mg·l^-1feso4·7h2o，2.1mg·l^-1na2·edta·2h2o。

花柄组织不定芽诱导培养基及培养条件：基本培养基中附加3.5mg·l^-1氯吡苯脲(cppu)和1.0mg·l^-1kt，6.7g·l^-1琼脂粉，添加40g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值至6.2；花柄组织接种后培养瓶置于光照周期8h·d^-1、光照强度900lx和温度28±2℃条件下培养。

不定芽生根复壮培养基及培养条件：基本培养基中附加0.05mg·l^-1iaa，6.8g·l^-1琼脂粉，添加15g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值为6.0。不定芽接种后培养瓶置于光照周期10h·d^-1、光照强度1300lx和温度26±2℃条件下培养。

1.2.3操作方法

(1)材料处理：在超净工作台内，将1.1中经消毒灭菌后的花柄纵向切开，切割成1.0cm的小段形成花柄组织，放入过滤灭菌消毒的体积百分比浓度为0.05％、0.07％、0.09％、0.11％、0.13％、0.15％、0.17％、0.19％甲基磺酸乙酯(ems)以及作为对照液的磷酸盐缓冲液(ck，为0％)中浸泡，浸泡时间为20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min以及对照液(ck，为60min)(浸泡时间依据花柄组织死亡率经预实验获得)，浸泡后用无菌水冲洗花柄组织15次，以备接种；

(2)花柄组织不定芽诱导培养：将上述经过ems浸泡后的花柄组织转接到花柄组织不定芽诱导培养基(培养基成分见1.2.2)中，并光照周期8h·d^-1、光照强度900lx和温度28±2℃条件下培养72天，花柄组织上部茎皮上产生独立、可分离的不定芽，并继续培养20天，不定芽长至0.8cm；

(3)不定芽生根复壮培养：当上述不定芽长至0.8cm时，将不定芽剥离转接到不定芽生根复壮培养基(培养基成分见1.2.2)中进行生根复壮培养，同时置于光照周期10h·d^-1、光照强度1300lx和温度26±2℃条件下培养35天，不定芽完全生长发育成含有根和茎叶的小植株；

(4)移栽和定植及品系确定：当小植株在培养瓶中长到2.0cm左右时，从瓶中取出经驯化炼苗后栽植到营养钵中，待长至30cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况。根据其长势、茎、株型等初步形态特征差别进行分类上标签，并将差异植株进行组培快繁后不同适宜地域栽培，根据长势、形态特性、萌芽力、茎干强弱、植株老化和退化情况、产量和抗性以及种子苗遗传情况等因素筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号(品系代码)。

为了减少实验次数以及确保甲基磺酸乙酯体积比浓度与浸泡时间两因素匹配的合理性，通过均匀设计法设计试验，选用u8(8²)均匀表，每个处理接种50个花柄组织，重复3次，筛选并确定影响牛尾菜花柄切片组织分化突变体的ems体积比浓度和浸泡时间最佳配比。突变率＝突变体数/由不定芽形成的小植株并栽培成活植株总数×100％。

2结果与分析

2.1ems体积比浓度和浸泡时间对牛尾菜花柄组织分化突变体的影响

表1影响牛尾菜花柄组织分化突变体因素筛选的u8(8²)试验设计与结果

试验所得数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为y＝-0.638+5.83x1+0.0244x2，显著性水平α＝0.05，复相关系数r＝0.8762，剩余标准差s＝0.227，检验值ft＝8.265﹥临界值f(0.05,2,5)＝5.786，回归方程具有显著性，说明甲基磺酸乙酯体积比浓度和浸泡时间对牛尾菜花柄组织突变的影响均显著，具有一定规律性突变。通过计算甲基磺酸乙酯体积比浓度和浸泡时间对突变的贡献值和贡献率可知，u1＝0.524，u1/u＝61.3％；u2＝0.575，u2/u＝67.2％，说明甲基磺酸乙酯和浸泡时间对牛尾菜花柄组织突变的贡献相当。由回归方程可知ems体积比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，又因在预实验时以0.19％的ems浸泡55min，花柄组织成活率不足12％，尽管ems体积比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，ems体积比浓度和浸泡时间的增加导致花柄组织成活率降低也没有实验意义。

因此，根据试验结果和回归分析，为确保花柄组织成活率和较高的突变率，选择ems体积比浓度0.18％和浸泡时间为50min进行了验证试验，结果发现，接种后花柄组织成活率达85％以上，经5年栽培观察，突变率达1.91％，在栽培的157个单株中又获得3个遗传稳定的突变体。

经过ems浸泡后的花柄组织接种到花柄组织不定芽诱导培养基中培养72天左右，花柄组织上部茎皮上产生独立、可分离的不定芽，继续培养20天，不定芽伸长至0.8cm左右后，将不定芽剥离转接到不定芽生根复壮培养基中进行生根复壮培养，培养35天左右，不定芽完全生长发育成含有根和茎叶的小植株，小植株高度达1.5cm左右。通过以上系列试验可知，利用牛尾菜花柄组织通过ems浸泡与植物组织培养技术相结合的方法可获得较高的突变率，且突变体性状遗传稳定，可作为品系栽培和牛尾菜突变体库的构建。

迄今，所有单株经过3个适宜区域栽培12年，获得22个遗传稳定单株，其中1个为萌芽力强、茎干粗壮、采收时间长、产量高而稳定且抗性强的优良性状品系。以下为优良性状突变体品系的特性简介(品系图片详见图2)。

萌芽力强、茎干粗壮、采收时间长、产量高而稳定且抗性强的优良性状品系(品系代码：2015-019)：2015年，从ems诱导野生牛尾菜花柄组织产生的突变体中选出的单株，该品系茎干粗壮，分蘖力强。嫩茎暗紫色，含适量色素，嫩芽萌发力强。丰产、稳定性好，抗性强，采收期长，品质优良，产量高于野生种15％以上。适合吉林省东南部地区栽培。

本发明以牛尾菜花柄组织为材料，通过适宜浓度的甲基磺酸乙酯浸泡一定时间，再结合植物组织培养技术，通过采用花柄组织不定芽诱导、不定芽生根复壮等途径获得遗传稳定突变体，该突变体具有各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特征的新型的牛尾菜人工栽培品种，该品种遗传稳定，可作为品系栽培和构建牛尾菜突变体库。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。