一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法与流程

本发明属于植物的繁殖技术领域，具体涉及一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法。

背景技术：

朝鲜淫羊藿(epimediumkoreanumnakai)是小檗科淫羊藿属多年生宿根草本植物，集中分布在中国东北长白山地区。多生林下或灌丛中，海拔400-1500米，喜生于土壤疏松、土质肥沃、腐殖质含量较高的地方。朝鲜淫羊藿是中国传统的补益类中药材，《中华人民共和国药典》有收载，称其具有温补肾阳，强筋骨，祛风湿等功效，属长白山道地性中药材，可用于治疗阳萎遗精、早泄、小便失禁、关节冷痛、月经不调等症。淫羊藿药用成分为：淫羊藿苷、淫羊藿素、大黄素、甘草素、金丝桃苷、槲皮素、三十一烷、甾醇、棕榈酸、银杏醇、木兰花碱、花色素、咖啡酸等；其功能为：扩张冠状动脉血管、降血压镇咳、祛痰、平喘、抗菌、抗病毒及抗炎，治疗阳痿早泄、风湿性关节炎及妇科病。现代医学研究则指出，朝鲜淫羊藿除具有传统医学价值及使用范围以外，还有许多新的药理作用和用途，比如抗衰老、促进骨骼生长、改善造血系统障碍等等，因此，它的制品是现代医学及食品领域里最热门的产品之一，是极具开发价值的一种植物类药材，已进入“十大吉药”名录。

由于连年的大量采收，造成朝鲜淫羊藿野生资源锐减，收购量降低，品质下降。目前，朝鲜淫羊藿的人工驯化栽培和规范化种植尚未取得成功经验，药材商品完全来源于野生资源。在提倡保护性采收的同时，应当加强对朝鲜淫羊藿的育种、人工驯化和栽培生产的研究，暂未实现大面积人工栽培，仍在小范围摸索阶段。

在现有技术中，大多研究集中于朝鲜淫羊藿的人工驯化和栽培生产技术研究，未发现进行品种改良和选育新品种(系)的相关报道。通过人工驯化栽培研究发现其人工栽培不仅存在淫羊藿苷等主要成分不足且退化严重的现象，而且栽培过程中还存在烂根和病虫害严重等问题。因此，在研究朝鲜淫羊藿防病虫害的同时，急需开发抗性强的新品种，并应用于人工规模化栽培生产。

技术实现要素：

为了解决上述随着朝鲜淫羊藿需求量的增大，采集和消耗量已超过自然资源的再生能力，导致物种濒危以及朝鲜淫羊藿人工培养存在淫羊藿苷等主要成分不足且退化严重的现象和栽培过程中存在烂根和病虫害严重等问题。本发明提供一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

(1)材料选择与预处理：取5月上旬野生朝鲜淫羊藿新萌发的嫩茎，切割成0.5cm茎段后用75％乙醇涮洗7-10s后移至饱和次氯酸钠溶液浸泡2-5min，无菌水冲洗10次，并用无菌滤纸吸干表面水分，接着用无菌手术刀和镊子切割成0.1cm的嫩茎切片，分批放入不同浓度的ems溶液中，浸泡20-100min，然后用无菌水冲洗嫩茎切片组织12次以备接种；

(2)嫩茎切片胚性愈伤组织的诱导培养：将步骤(1)中经过ems浸泡后的嫩茎切片组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基中，并置于光照周期3h·d^-1、光照强度500lx和温度28±2℃条件下培养75天，嫩茎切片组织完全脱分化转变成红褐色的胚性愈伤组织，并进行胚性愈伤组织继代增殖培养；

(3)胚性愈伤组织再分化培养：将步骤(2)中胚性愈伤组织切割成适宜大小的组织块，并转接到胚性愈伤组织再分化培养基中，并置于光照周期13h·d^-1、光照强度1000lx和温度24±2℃条件下继续培养60天，胚性愈伤组织分化出具有独立性、两极性、可分离的胚状体；

(4)胚状体复壮生长培养：将步骤(3)中胚状体剥离后转接到胚状体复壮成长培养基中，并置于光照周期14h·d^-1、光照强度1200lx和温度26±2℃条件下进行复壮成长培养，培养至10天胚状体呈两极化生长，培养至40天胚状体完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；

(5)移栽和定植及品系确定：将步骤(4)中小植株驯化炼苗后植于营养钵中，待长至5-8cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况，并进行分类及注标签；接着将差异突变体进行组培快繁，再进行不同适宜地域栽培；最后进行筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号。

进一步的，步骤(1)中ems以浓度为0.1mol·l^-1、ph＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.2-1.6％的ems溶液。

进一步的，不同浓度的ems溶液分别为体积百分比0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％的ems溶液。

进一步的，培养基包括基本培养基，所述基本培养基的的成份包括下列物质：马铃薯上清液33g·l^-1；大量元素：206.25mg·l^-1nh4no3，237.5mg·l^-1kno3，55mg·l^-1cacl2·2h2o，46.25mg·l^-1mgso4·7h2o，21.25mg·l^-1kh2po4；铁盐：29.2mg·l^-1feso4·7h2o，12.5mg·l^-1na2·edta·2h2o。

进一步的，步骤(2)中培养基为基本培养基附加180g·l^-1油菜花提取液和1.1mg·l^-1iaa，以及6.8g·l^-1琼脂粉，38g·l^-1蔗糖。

进一步的，步骤(2)中培养基的ph值为6.0。

进一步的，步骤(3)中培养基为基本培养基附加220g·l^-1油菜花提取液、0.50mg·l^-1iaa和1.30mg·l^-1赤霉素，以及7.0g·l^-1琼脂粉，40g·l^-1蔗糖。

进一步的，步骤(3)中培养基的ph值为5.8。

进一步的，步骤(4)中培养基为基本培养基附加55g·l^-1油菜花提取液、0.05mg·l^-1iaa和0.75mg·l^-1赤霉素，以及6.8g·l^-1琼脂条，15g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值为6.0。

进一步的，突变体分类根据突变体叶片、茎、株型形态特征中的一种或多种进行差别分类；所述品系确定根据突变体长势、抗性、种子苗遗传情况、淫羊藿成分稳定性中的一种或多种因素进行筛选。

本发明提供一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法，具有以下有益效果：

(1)甲基磺酸乙酯(ems)的特性是作用于诱发点，使诱发点突变，不会导致染色体畸形，显性突变高，无需进一步遗传转化，可直接获得遗传稳定突变体，栽培多态性极小，可直接选择优良性状突变体作为品系栽培和品种审定，显著缩短了育种周期；

(2)本方法简捷多效、诱导后代突变率高、变异范围广、突变体遗传稳定性好、突变具有多样性等优点；

(3)本方法以朝鲜淫羊藿嫩茎组织为材料，应用ems与植物组织培养技术相结合，采用胚性愈伤组织诱导、再分化、胚状体复壮等方法，使得各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特点，并可进一步应用于朝鲜淫羊藿突变体库的构建。

附图说明

图1为朝鲜淫羊藿含有胚状体的嫩茎胚性愈伤组织的结构图；

图2中a为野生朝鲜淫羊藿植株；

b为朝鲜淫羊藿突变体品系植株(品系代码：2007-017)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。

如图1和2所示，一种诱导朝鲜淫羊藿嫩茎组织突变的新品种培育方法，包括以下步骤：

1材料与方法

1.1材料选取与预处理

5月上旬，选取野生朝鲜淫羊藿新萌发的嫩茎，切割成0.5cm茎段后用75％乙醇(体积百分比浓度)涮洗8s后移至饱和次氯酸钠溶液(质量浓度)浸泡3min，无菌水冲洗10次，无菌滤纸吸干表面水分备用。

1.2方法

1.2.1甲基磺酸乙酯(ems)溶液配制

ems以浓度为0.1mol·l^-1、ph＝7的磷酸盐缓冲液作为溶剂配制成体积百分比浓度为0.2-1.6％的ems溶液；

即以ph7.0的0.1mol·l^-1的磷酸盐缓冲液作为溶剂，将甲基磺酸乙酯(ems)配制成体积百分比浓度(v·v^-1)溶液，浓度分别为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％，以及磷酸盐缓冲液作为对照液(ck)；该浓度范围依据嫩茎段切片组织死亡率经预实验获得，使用前需过滤灭菌消毒。

1.2.2培养基配制

基本培养基成份和用量为：马铃薯上清液33g·l^-1；大量元素：206.25mg·l^-1nh4no3，237.5mg·l^-1kno3，55mg·l^-1cacl2·2h2o，46.25mg·l^-1mgso4·7h2o，21.25mg·l^-1kh2po4；铁盐：29.2mg·l^-1feso4·7h2o，12.5mg·l^-1na2·edta·2h2o。

嫩茎切片胚性愈伤组织诱导培养基及培养条件：基本培养基中附加180g·l^-1油菜花提取液和1.1mg·l^-1iaa，6.8g·l^-1琼脂粉，添加38g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值至6.0；嫩茎切片接种后培养瓶置于光照周期3h·d^-1、光照强度500lx和温度28±2℃条件下培养。

胚性愈伤组织再分化培养基及培养条件：基本培养基中附加220g·l^-1油菜花提取液、0.50mg·l^-1iaa和1.30mg·l^-1赤霉素，7.0g·l^-1琼脂粉，添加40g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值至5.8。胚性愈伤组织接种后培养瓶置于光照周期13h·d^-1、光照强度1000lx和温度24±2℃条件下培养。

胚状体复壮生长培养基及培养条件：基本培养基中附加55g·l^-1油菜花提取液、0.05mg·l^-1iaa和0.75mg·l^-1赤霉素，6.8g·l^-1琼脂条，添加15g·l^-1蔗糖，并调节培养基ph值至6.0。胚状体接种后培养瓶置于光照周期14h·d^-1、光照强度1200lx和温度26±2℃条件下培养。

1.2.3操作方法

(1)材料处理：在超净工作台内，将1.1中经消毒灭菌后的茎段用无菌手术刀和镊子切割成0.1cm的茎段切片，分批次放入过滤灭菌消毒的体积百分比浓度为0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.4％、1.6％的甲基磺酸乙酯(ems)以及作为对照液的磷酸盐缓冲液(ck，为0％)中浸泡，浸泡时间为20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min以及对照液(ck，为100min)，该浸泡时间依据嫩茎切片组织死亡率经预实验获得；浸泡后用无菌水冲洗嫩茎段切片组织12次，以备接种；

(2)嫩茎切片胚性愈伤组织的诱导培养：将上述经过ems浸泡后的嫩茎切片组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基(培养基成分见1.2.2)中，并置于光照周期3h·d^-1、光照强度500lx和温度28±2℃条件下培养75天，嫩茎切片组织完全脱分化转变成红褐色的胚性愈伤组织(如图1所示)，并进行胚性愈伤组织继代增殖培养；

(3)胚性愈伤组织再分化培养：将胚性愈伤组织切割成适宜大小的组织块，并转接到胚性愈伤组织再分化培养基(培养基成分见1.2.2)中，并置于光照周期13h·d^-1、光照强度1000lx和温度24±2℃条件下继续培养60天，胚性愈伤组织分化出具有独立性、两极性、可分离的胚状体；

(4)胚状体复壮生长培养：将胚状体剥离后转接到胚状体复壮成长培养基(培养基成分见1.2.2)中，并置于光照周期14h·d^-1、光照强度1200lx和温度26±2℃条件下进行复壮成长培养，培养至10天胚状体呈两极化生长，培养至40天胚状体完全发育生长为含有根和茎叶的小植株；

(5)移栽和定植及品系确定：将上述小植株驯化炼苗后植于营养钵中，待长至5-8cm时，定植栽培到田间，观察其生长情况(如图2所示)。根据其叶片、茎、株型等形态特征差别进行分类，并注标签；将差异突变体进行组培快繁，接着进行不同适宜地域栽培，根据长势、抗性、种子苗遗传情况及淫羊藿苷稳定性等因素筛选确定遗传稳定的优良性状突变体作为品系，并进行编号(品系代码)，品系可进一步进行栽培和新品种审定。

为确保甲基磺酸乙酯体积百分比浓度和浸泡时间两因素匹配的合理性以及减少实验次数，通过均匀设计法设计试验，选用u8(8²)均匀表，每个处理接种50个嫩茎切片组织，重复3次，筛选确定影响朝鲜淫羊藿嫩茎切片胚性愈伤组织再分化突变体的ems体积百分比浓度和浸泡时间最佳配比。突变率＝突变体数/胚状体形成的小植株并栽培成活植株总数×100％。

2结果与分析

2.1ems体积百分比浓度和浸泡时间对朝鲜淫羊藿嫩茎切片胚性愈伤组织再分化突变体的影响

表1影响朝鲜淫羊藿嫩茎切片胚性愈伤组织再分化突变体因素筛选的u8(8²)试验设计与结果

试验所得数据(表1)经均匀设计软件分析处理后可得回归方程为y＝0.276+1.12x1+0.0134x2，显著性水平α＝0.05，复相关系数r＝0.9031，剩余标准差s＝0.311，检验值ft＝11.06﹥临界值f(0.05,2,5)＝5.786，回归方程具有显著性，甲基磺酸乙酯体积百分比浓度和浸泡时间对朝鲜淫羊藿嫩茎切片组织突变的影响均显著，具有一定规律性突变。通过计算甲基磺酸乙酯体积百分比浓度和浸泡时间对突变的贡献值和贡献率可知，u1＝1.93，u1/u＝90.3％；u2＝0.694，u2/u＝32.5％，说明甲基磺酸乙酯对突变的贡献显著大于浸泡时间。由回归方程可知ems体积百分比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，又因在预实验时以1.6％的ems浸泡90min，嫩茎切片组织成活率不足10％，尽管ems体积百分比浓度和浸泡时间均与突变率呈正相关，ems体积百分比浓度和浸泡时间的增加导致嫩茎切片组织成活率降低也没有意义。

因此根据试验结果和回归分析，为保证嫩茎切片组织成活率和较高的突变率，选择甲基磺酸乙酯体积百分比浓度1.50％和浸泡时间为80min进行了验证试验，结果发现，接种后嫩茎切片组织成活率达90％以上，经7年栽培观察，突变率达3.88％，在栽培的103个单株中又获得4个遗传稳定的突变体。

经过甲基磺酸乙酯浸泡后的嫩茎切片组织转接到胚性愈伤组织诱导培养基中通过75天左右的培养，嫩茎切片组织完全脱分化转变成红褐色的胚性愈伤组织。将胚性愈伤组织切割成适宜大小的组织块转接到胚性愈伤组织再分化培养基中继续培养，胚性愈伤组织培养60天左右，胚性愈伤组织分化出具有独立性、两极性、可分离的胚状体。将胚状体剥离后转接到胚状体复壮成长培养基中进行复壮成长培养，培养10天，胚状体呈两极化生长，培养至40天左右，胚状体完全发育生长为含有根和茎叶的小植株。通过以上系列试验可知，利用朝鲜淫羊藿嫩茎切片组织通过甲基磺酸乙酯浸泡与植物组织培养技术相结合的方法可获得较高的突变率，且突变体性状遗传稳定，可作为品系进行栽培和构建朝鲜淫羊藿突变体库。

迄今，经过5个适宜区域栽培7年，获得32份遗传稳定的突变体单株，其中，1个为淫羊藿苷等主要成分含量稳定且抗性强的优良性状突变体单株，可作为品系应用于人工栽培。以下为优良性状突变体品系的特性简介(品系图片详见图2)。

特性简介：淫羊藿苷等主要成分含量稳定且抗性强的优良性状突变体品系(品系代码：2007-017)：2007年，从ems诱导野生朝鲜淫羊藿嫩茎切片组织产生的突变体中选出的单株，该品系根粗壮且根芽多，叶表面和背面局部不规则性红色，茎和分支红色；丰产、稳定性好，抗性强；淫羊藿苷、淫羊藿素、大黄素、甘草素、金丝桃苷、槲皮素等主要活性成分含量为稳定，产量高于野生种15％以上。适合吉林省东南部地区栽培。

本发明以朝鲜淫羊藿嫩茎材料，利用甲基磺酸乙酯(ems)与植物组织培养技术相结合，采用胚性愈伤组织诱导、再分化、胚状体复壮等方法，获得各单株独立性强、单株遗传信息纯度高、单株来源清晰等特征的新型的朝鲜淫羊藿人工栽培品种，对朝鲜淫羊藿种群的扩增具有重要的保护和生态意义，并且该方法可进一步应用于朝鲜淫羊藿突变体库的构建以及直接作为品系进行栽培和品种审定。

上述仅为本发明的优选具体实施方式，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。