本发明属于植物育种
技术领域：
，具体涉及一种克服睡莲种间杂交障碍的方法。
背景技术：
：睡莲是睡莲属(nymphaea)植物的统称，国内外共有睡莲原生种50个左右，中国分布的原生种有5个。近年来，随着人民生活水平的提高和休闲农业的蓬勃发展，对花色丰富和花期长的睡莲新品种的需求日益增多。因此，睡莲新品种的选育工作尤为重要。目前，杂交育种仍是睡莲新品种选育的主要手段。但是，目前，睡莲种间跨亚属杂交遇到难题，特别是耐寒睡莲与热带睡莲杂交亲和性较差，导致杂交结实率较低或不结实，严重影响了热带睡莲优异花色基因向耐寒睡莲种转移，因此解决这一难题对睡莲特异花色新品种的选育具有重要意义。技术实现要素：针对现有技术中存在的问题，本发明要解决的技术问题是提供一种克服睡莲种间杂交障碍的方法，该方法能够提高耐寒睡莲与热带睡莲杂交亲和性，同时可得到耐寒睡莲与热带睡莲杂交种。为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：一种克服睡莲种间杂交障碍的方法，对采集到的母本花粉进行阴干处理；然后采集新鲜的父本花粉和母本柱头液，母本柱头液作为授粉液使用；最后将处理后的母本花粉、新鲜的父本花粉和授粉液混合后进行授粉，得到杂交种子。具体包括以下步骤：步骤一、在睡莲开花前一天，将母本花蕾和父本进行套袋隔离，于开花第二天收集新鲜的母本花粉，将收集的花粉置于培养皿中自然阴干；步骤二、于母本开花当天早晨取套袋隔离母本花序的柱头液，作为授粉液使用；步骤三、在母本开花当日的早晨，采集父本新鲜的花粉，将步骤一处理后的母本花粉与新鲜的父本花粉混合，然后加入步骤二中的授粉液，混合均匀后作为授粉液使用；将母本待授粉花序去雄，用吸管吸干授粉花序的柱头液并立即添加上述授粉液，授粉结束后继续套袋隔离。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，向授粉液中加入硼酸和氯化钙。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，所述硼酸的浓度为5～15mg/l，氯化钙的浓度为400～800mg/l。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，所述硼酸的浓度为10mg/l，氯化钙的浓度为600mg/l。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，花粉阴干的环境是黑暗条件下保持温度20-24℃，阴干时间为1个月。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，混合时处理后的母本花粉与新鲜的父本花粉的质量比为10∶1。所述克服睡莲种间杂交障碍的方法，混合花粉与授粉液的质量比为1∶100。有益效果：与现有的技术相比，本发明的优点包括：(1)本发明方法科学合理：耐寒睡莲与热带睡莲种间存在障碍的主要因素是受精前障碍，即花粉在柱头上萌发率低甚至不萌发。因此，本发明将处理的母本花粉与新鲜父本花粉混合，促进睡莲杂交过程中柱头与花粉的识别，进而促进花粉管的萌发和继续生长。同时，在授粉液中添加硼酸和氯化钙，也有助于花粉的萌发。(2)本发明比较了硼酸和氯化钙不同添加比例对杂交效果的影响，筛选出授粉液中添加10mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙效果较好。(3)本发明有效的克服睡莲种间杂交障碍，使得不同花色、花型的睡莲种间杂交成功，交换了睡莲种间的优异基因，实现了部分种间杂交，创造一批新种质。具体实施方式为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。实施例1一、材料选择‘彼得’(nymphaea‘peterslocum’)和小花(nymphaeamicrantha)(均为公知品种，见参考文献黄国振，邓惠勤，李祖修，李钢.睡莲.中国林业出版社，北京，2009)，‘彼得’花色是淡粉色花，花型是杯状，而小花花色是淡蓝紫色，花型星形。若将小花的花色转移到‘彼得’上，将培育出多瓣花色漂亮的淡蓝紫色花，事实上，经过多年杂交实践，‘彼得’与小花杂交得不到杂交种子，其主要原因在于存在受精前障碍。二、‘彼得’和小花杂交种的获得，具体包括以下步骤：步骤一、在开花前一天，将‘彼得’花蕾进行套袋隔离，于开花第二天上午大量收集新鲜的‘彼得’花粉，将收集的花粉置于干燥的培养皿中，在黑暗条件下保持温度20℃-24℃放置1个月自然阴干；步骤二、在‘彼得’和小花开放前一天，对‘彼得’和小花各5个花序进行套袋隔离；步骤三、于‘彼得’开花当天早晨，取套袋隔离‘彼得’花序的柱头液，用‘彼得’柱头液按照下列组分配制授粉液：10mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙；步骤四、在‘彼得’开花当日的早晨，采集套袋隔离小花花序新鲜的花粉，将处理的‘彼得’花粉与新鲜的小花花粉按照10∶1的比例混合，混合后加入配制好的授粉液(父本花粉和母本花粉组成的混合花粉与授粉液的质量比为1∶100)，混合均匀后进行授粉。授粉时，先将‘彼得’待授粉花序去雄，用吸管吸干授粉花序的柱头液并立即添加上述授粉液0.8ml，授粉结束后继续套袋隔离。于授粉后25-30天收集杂交种子。‘彼得’和小花采用常规杂交方式进行杂交，具体操作包括以下步骤：步骤一、在‘彼得’和小花开花前，将其花蕾进行套袋隔离，于‘彼得’开花当天收集新鲜的小花花粉；步骤二、于‘彼得’开花当天收集套袋隔离花序的柱头液，将新鲜小花花粉混合‘彼得’柱头液作为授粉液使用，其中小花花粉与‘彼得’柱头液的质量比为1∶100；步骤三、于‘彼得’开花当天，将‘彼得’去雄，并将‘彼得’柱头液用吸管吸干，吸干后添加步骤二的授粉液0.8ml。步骤四、授粉结束后，将授粉花序套袋隔离。采用本发明杂交方法和常规杂交方法得到的结实率结果如表1所示，由表1可知，采用本发明杂交方法，可显著提高‘彼得’×小花杂交亲和性，杂交结实率由0提高到2.23％。说明本发明将处理的母本花粉与新鲜父本花粉混合，促进睡莲杂交过程中柱头与花粉的识别，进而促进花粉管的萌发和继续生长。同时，在授粉液中添加硼酸和氯化钙，也有助于花粉的萌发。该方法有效的克服睡莲种间杂交障碍，使得不同花色、花型的睡莲种间杂交成功，交换了睡莲种间的优异基因，实现了部分种间杂交，创造一批新种质。表1不同杂交方式对杂交结实率的影响‘彼得’×小花杂交方式结实率(％)常规杂交0a本发明杂交方式2.23±0.20b注：采用duncan′smultipleramgetest方法分析，同一列不同字母表示显著性差异(p＜0.05，n＝3)。实施例2为了研究硼酸和氯化钙加入量对‘彼得’和小花杂交结实率的影响，该实施例设置了10组实验，硼酸和氯化钙的加入量如表2所示；杂交方法采用本发明杂交方法，具体步骤同实施例1，杂交结实率结果如表2所示。由表2可知，添加了硼酸的氯化钙之后的杂交结实率均高于没有添加硼酸和氯化钙的实验组，说明硼酸和氯化钙的添加确实有助于杂交结实率的增加。另外，添加不同浓度的硼酸和氯化钙会不同程度的影响‘彼得’×小花杂交结实率，其中授粉液中添加10mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙能显著提高其杂交结实率。表2硼酸和氯化钙的浓度对杂交效果的影响组别硼酸和氯化钙的浓度‘彼得’×小花杂交结实率(％)10mg/l的硼酸和0mg/l氯化钙0.40+0.10a25mg/l的硼酸和400mg/l氯化钙0.63±0.15ab35mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙0.60±0.12ab45mg/l的硼酸和800mg/l氯化钙0.47±0.15ab510mg/l的硼酸和400mg/l氯化钙1.37±0.31c610mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙2.23±0.20b710mg/l的硼酸和800mg/l氯化钙1.03±0.23bc815mg/l的硼酸和400mg/l氯化钙0.50±0.12ab915mg/l的硼酸和600mg/l氯化钙0.40+0.12a1015mg/l的硼酸和800mg/l氯化钙0.75±0.06ab注：采用duncan′smultipleramgetest方法分析，同一列不同字母表示显著性差异(p＜0.05，n＝3)。当前第1页12