一种人离体牙保存液及其制备方法与流程

本发明涉及一种人离体牙的保存液。

本发明还涉及一种人离体牙保存液的制备方法。

背景技术：

间充质干细胞(msc)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织，牙髓中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。

目前儿童换牙期的乳牙和成人正畸取下的第三磨牙大都当作医疗废弃物扔掉，但是研究发现，牙髓腔内的牙髓组织富含大量的干细胞，可自我更新和多向分化，有着较强的复制能力。可以用于牙周炎、牙周再生、生物牙根再生、口腔骨缺损修复等口腔疾病，更能修复组织和器官的病变、损伤，拥有治疗多种疾病、调节免疫、抗衰老的能力。并且因其免疫原性比较低，排斥反应较小，可以异体使用。

但牙髓在牙齿中的含量很少，且容易萎缩，因此发明一种保存液，能够有效维持牙髓的代谢和细胞活力，预防采集和运输环节的外源污染，为后续牙髓干细胞的分离培养及临床应用打下基础。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提供一种人离体牙的保存液。

本发明还提供一种人离体牙保存液的制备方法。该保存液能够有效的维持牙髓组织的细胞活力和形态，在7天内维持其生物特性，从而显著提高牙髓干细胞的分离效率，为牙髓干细胞临床治疗奠定基础。

本发明提供如下技术方案：

一种人离体牙的保存液，它包含如下成分：人血清白蛋白(v/v)4-8％，虾青素(w/v)1-10umol/l，α-亚麻酸(w/v)4-10ug/ml，枸橼酸钠(v/v)5-10％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.2-0.5ug/ml，两性霉素b0.01-0.02mg/ml，上清浓缩液和质量浓度0.9％的氯化钠注射液。

优选的，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：19稀释混匀后，作为基础液。

优选的，人离体牙保存液的各成分为：人血清白蛋白(v/v)6％，虾青素(w/v)5umol/l，α-亚麻酸(w/v)7ug/ml，枸橼酸钠(v/v)7％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.4ug/ml，两性霉素b0.015mg/ml。

所采用的试剂均在配置前过滤除菌。

上清浓缩液的制备：取p1代牙髓干细胞接种于培养瓶，加入无血清培养基，置于37℃、饱和湿度、co2体积分数为5％的培养箱内培养，细胞长至80％-90％融合度，收集细胞上清液，此时可对细胞进行连续传代扩增至p5代，收集细胞长至80-90％汇合度时的上清液。

人血清白蛋白：是血浆中含量最多的蛋白质，占血浆总蛋白的40％～60％。能够维持血浆胶体渗透压的恒定且承担一定的运输功能。添加白蛋白可以为干细胞提供营养，提高干细胞的存活率。

虾青素：作为一种抗氧化剂，独特的分子结构，使其具有强大的清除氧自由基、抑制单线态氧的能力，可有效地阻止氧原子与细胞膜的不饱和脂肪酸相互作用，阻止氧化反应的进行，从而保护细胞及dna免受氧化反应的伤害。其具有脂溶特性，可以中和细胞内的自由基，保护细胞内的蛋白质，使细胞有效进行新陈代谢，使细胞内的蛋白质更好的发挥功能，抑制自由基对机体的氧化损害，可以穿越细胞外壁，直接清除细胞内的氧自由基，增强细胞再生能力。

α-亚麻酸：是构成细胞膜和生物酶的基础物质，对人体健康起决定性作用，α亚麻酸作为生长、细胞代谢及肌肉运动供能的同时，还发挥结构功能和调控功能。

枸橼酸钠：又称柠檬酸钠，能与血液中的钙离子结合形成螯合物，从而防止血液凝固。

注射用盐酸头孢吡肟：第四代半合成头孢菌素，对革兰氏阳性菌和阴性菌都有较强的抗菌活性，对β-内酰胺酶稳定。

两性霉素b：能有效抑制和杀灭真菌。

上清浓缩液：干细胞上清液是细胞培养的营养液，细胞增殖过程中的营养吸收和因子的分泌都是在上清液中进行交换和完成的，牙髓间充质干细胞分泌的血小板来源生长因子(pdgf)、表皮生长因子(egf)、血管内皮生长因子(vegf)、成纤维细胞生长因子(fgf)、胰岛素生长因子(igf-1、igf-ii)、神经生长因子(ngf)、白细胞介素类生长因子(il-1、il-2、il-3)等细胞因子有效维持牙髓干细胞的活力。

质量浓度0.9％的氯化钠注射液：临床上常用的渗透压与人体血浆等渗的氯化钠溶液。本发明采用0.9％的氯化钠溶液，临床医用级别的，与人体的细胞渗透压一致，作为溶剂，能够为细胞提供等渗环境。

本发明的一种人离体牙保存液的制备方法，包括以下步骤：在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液按质量比1:18-20稀释混匀后，作为基础液，向基础液内加入人血清白蛋白(v/v)4-8％，虾青素(w/v)1-10umol/l，α-亚麻酸(w/v)4-10ug/ml，枸橼酸钠(v/v)5-10％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.2-0.5ug/ml，两性霉素b0.01-0.02mg/ml，放入无菌瓶内充分混匀后，置入恒温震荡摇床，10-15℃，100-120rpm，震荡15-20min，制备得到离体牙保存液，2-8℃保存。

优选的，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液按质量比1：19稀释混匀。

优选的，人离体牙保存液的各成分为：人血清白蛋白(v/v)6％，虾青素(w/v)5umol/l，α-亚麻酸(w/v)7ug/ml，枸橼酸钠(v/v)7％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.4ug/ml，两性霉素b0.015mg/ml。

人离体牙的保存方法，包括如下步骤：

乳牙或第三磨牙是乳牙适龄人群和成人由于正畸治疗需要提前拔出的第三磨牙，在专业的采集机构进行牙齿的采集，牙齿取下经消毒后，放入含有保存液的采集瓶内，2-8℃保存，最优为4℃，保存时间为7天。

离体牙含健康乳牙和第三磨牙。乳牙或是第三磨牙是乳牙适龄人群和成人由于正畸治疗需要提前拔出的第三磨牙，在专业的采集机构进行牙齿的采集。

离体牙保存在本发明的保存液内，在2-8℃环境下保存7天，仍能够分离出干细胞，干细胞表面标志cd73、cd90、cd105大于95％，cd34，hla-dr低于2％。细胞活力好。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：该保存液以上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液作为基础液，加入人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b。该保存液成分明确，营养均衡，对细胞无毒副作用，在2-8℃能够很好的维持离体牙髓的细胞活力，在7天内维持其生物特性，从而显著提高牙髓干细胞的分离效率。

附图说明

图1：保存液保存7天的乳牙牙髓组织块爬出的p0代干细胞。

图2：保存液保存7天的磨牙牙髓组织块爬出的p0代干细胞。

图3：保存液保存7天的乳牙牙髓p1代干细胞。

图4：保存液保存7天的磨牙牙髓p1代干细胞。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

上清浓缩液的制备：取p1代牙髓干细胞以按1×10⁵/ml密度接种于t75培养瓶，每瓶加入16ml无血清培养基，置于37℃、饱和湿度、co2体积分数为5％的培养箱内培养，细胞长至80％-90％融合度，收集细胞上清液，此时可对细胞进行连续传代扩增至p5代，收集细胞长至80-90％汇合度时的上清液。

上清液的浓缩：将收集的上清液经0.22μm的滤膜过滤，然后通过分子量为50kd的vivaflow50回旋流/切向流超滤器进行干细胞上清液的浓缩，接着将浓缩液通过分子量为3kd的vivaflow50回旋流/切向流超滤器，收集截留液，-20℃或-80℃保存。干细胞上清液浓缩倍数在38-42倍。

以下实施例2-7是保存液的制备方法。

实施例2

在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：18稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)4％，虾青素(w/v)1umol/l，α-亚麻酸(w/v)4ug/ml，枸橼酸钠(v/v)5％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.2ug/ml，两性霉素b0.01mg/ml；放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，10℃，120rpm，震荡15min，制备得到离体牙保存液，2℃保存。

实施例3

在无菌情况下，取上清浓缩液与0.9％的氯化钠注射液1：19稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)5％，虾青素(w/v)3umol/l，α-亚麻酸(w/v)5ug/ml，枸橼酸钠(v/v)6％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.3ug/ml，两性霉素b0.01mg/ml；放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，10℃，100rpm，震荡20min，制备得到离体牙保存液，4℃保存。

实施例4

在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：19稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)6％，虾青素(w/v)5umol/l，α-亚麻酸(w/v)7ug/ml，枸橼酸钠(v/v)7％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.4ug/ml，两性霉素b(w/v)0.015mg/ml；充分混匀后制备成保存液。放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，15℃，100rpm，震荡15min，制备得到离体牙保存液，4℃保存。

实施例5

在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：19稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)7％，虾青素(w/v)8umol/l，α-亚麻酸(w/v)8ug/ml，枸橼酸钠(v/v)8％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.4ug/ml，两性霉素b(w/v)0.015mg/ml；放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，15℃，120rpm，震荡20min，制备得到离体牙保存液，6℃保存。

实施例6

在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：19稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)8％，虾青素(w/v)9umol/l，α-亚麻酸(w/v)9ug/ml，枸橼酸钠(v/v)9％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.5ug/ml，两性霉素b(w/v)0.02mg/ml；放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，12℃，110rpm，震荡18min，制备得到离体牙保存液，7℃保存。

实施例7

在无菌情况下，取上清浓缩液与质量浓度0.9％的氯化钠注射液1：20稀释混匀后，作为基础液，向基础液中加人血清白蛋白，虾青素，α-亚麻酸，枸橼酸钠，注射用盐酸头孢吡肟，两性霉素b；使其终浓度分别为人血清白蛋白(v/v)8％，虾青素(w/v)10umol/l，α-亚麻酸(w/v)10ug/ml，枸橼酸钠(v/v)10％，注射用盐酸头孢吡肟(w/v)0.5ug/ml，两性霉素b(w/v)0.02mg/ml；放入无菌瓶内，置入恒温震荡摇床，12℃，120rpm，震荡20min，制备得到离体牙保存液，8℃保存。

人离体牙的采集：供者经三甲医院检测hbv抗原、抗hcv抗体，抗hiv抗体、抗梅毒螺旋体抗体、cmv-igm、ebv、支原体检测项目均为阴性。乳牙或是第三磨牙是乳牙适龄人群和成人由于正畸治疗需要提前拔出的第三磨牙，在专业的采集机构进行牙齿的采集，牙齿取下经消毒后，放入含有保存液的采集瓶内，2-8℃保存；分别抽取10颗乳牙和10颗智齿放入本发明实施例4方法制备得到的保存液，在2-8℃保存环境保存7天后通过组织块法培养细胞，对牙齿的无菌性、细胞生长情况和细胞的表型进行分析。

将牙齿从保存液中取出，平放在无菌皿内，用0.9％的生理盐水洗涤2次，用无菌器械将牙齿挤裂，取出牙髓。放入离心管内，用顿头剪刀剪成1mm³左右小块，以0.2g/1ml/孔的密度接种6孔板培养，每3天全量换液一次，观察细胞的爬出时间和细胞的生长情况。

结果保存的20颗牙齿均无污染发生，与新鲜牙齿相比(乳牙2-3天；磨牙3-4天，观察到组织块周围有细胞)，保存7天的乳牙牙髓干细胞爬出时间在3-4天，成人第三磨牙牙髓干细胞爬出时间在3-6天，乳牙和磨牙牙髓爬出的细胞呈典型的梭形，细胞核清晰与新鲜牙髓干细胞在形态上无明显区别，如图1和2。组织块培养10-14天细胞达到85％以上汇合度，细胞1：3传代后，2-3天达到85％以上汇合度，如图c和d。将细胞培养至p3-5代进行细胞表型检测。

细胞表型检测

将p3-p5代细胞悬液1500rpm离心6min，将细胞沉淀用dpbs洗涤2次，取0.8～1×10⁶，100ul细胞悬液放于ep管中，加入一抗15ul(空白管不加一抗)，4℃避光孵育30min，加入400uldpbs，1500rpm离心6min，弃去上清，加入10ul的二抗，4℃避光孵育30min后，加入400uldpbs，1500rpm离心6min，弃去上清，加入500uldpbs混匀后转移到流式上机管中，上机检测。结果表1。

表1：流式检测结果

由图1-4和表1的检测数据可知，经过本保存液保存的离体牙所提取的干细胞细胞饱满，折光性好，呈典型的梭形和纺锤体型，流式检测显示细胞高表达cd73、cd90、cd105等间充质干细胞的特异性蛋白，表达率大于95％，而cd34，hla-dr，表达率低于2％。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。