本发明涉及菌丝体培养方法及其应用，特别涉及一种桑黄菌丝体的培养方法、饮品及其应用。
背景技术：
桑黄(phellinusbaumii)是一种名贵的药用真菌，又称桑耳、胡孙眼、桑黄菇等。桑黄属担子菌亚门(basidiomycotas)层菌纲(hymenomycetes)、非褶菌目(aphyllophorales)锈革孔菌科(hymenochaetaceae)针层孔菌属(phellinusquel)，主要包括火木针层孔菌(phellinusigniarius)、裂蹄针层孔菌(phellinuslinteus)和鲍氏针层孔菌(phellinusbaumii)。桑黄是目前国际公认的生物抗癌领域中有效率并排在第一位的药用菌。近年来，国内外学者对桑黄的药理作用及化学成分作了进一步的研究，表明桑黄具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节作用、保肝和抗肝硬化作用、抗脂质过氧化作用；抗诱变、降血糖、抗肺炎、抑菌和消炎作用等。
近年来，国内外市场对桑黄需求量的不断增大，而人工栽培桑黄技术不成熟，品质也不够稳定，造成国内对野生桑黄资源的掠夺性开采现象非常严重，致使桑黄野生资源濒临枯竭。
通过液体发酵所得桑黄菌丝体，其多糖含量、营养价值及有效成分不低于子实体，因而具有广阔的开发和应用前景。桑黄菌液体培养最大的优点利于进行工厂规模化连续生产，具有发酵周期短、生产效益高等特点。发酵培养得到的菌丝体可以作为液体菌种，在固体培养基的接种应用方面，具有流动快、易分散、萌发快、发菌点多等特点。发酵液等也可以直接作药用或供分离提取，能够有效弥补对野生桑黄菌资源的过度开发和利用。
技术实现要素：
发明目的：本发明通过对桑黄的培养方法进行摸索，采用常见玉米粉及麸皮等农副下脚料，降低培养成本，并通过摇床培养和液体深层发酵得到桑黄菌丝球，且该方式易于大量获得桑黄菌丝体。本发明的另一个目的是提供了一种桑黄饮品，经真空冷冻干燥方式得菌丝粉，最大程度保留桑黄液体发酵的功效成分使饮品中的营养成分、活性物质、酶活性都较少丢失或受到破坏，保证产品的质量和提高人体免疫力增强体质的保健效果。
技术方案：本发明第一方面提供了一种桑黄菌丝体的培养方法，包含以下步骤：
(1)摇瓶扩大培养：将桑黄菌种接种到斜面培养基上，进行斜面培养；将经过斜面培养的桑黄菌种接种到摇瓶培养基中，进行一级摇瓶培养；将经过一级摇瓶培养桑黄菌种的接种到摇瓶培养基中进行二级摇瓶培养，所得桑黄菌种为生产摇瓶二级种；
(2)种子罐扩大培养：步骤(1)中培养的生产摇瓶二级种接入发酵培养基中，进行扩大培养，得到一级桑黄菌种；
(3)发酵罐扩大培养：将步骤(2)得到的一级桑黄菌种接入装有发酵培养基的发酵罐中进行发酵罐培养，过滤，得桑黄菌丝体。
本发明第二方面提供了一种由上述培养方法培养的桑黄菌丝体。
本发明第三方面提供了桑黄菌丝体在饮品中的应用。
本发明第四方面提供了一种由上述的培养方法得到的桑黄菌丝体制备的桑黄菌丝冻干粉。
本发明第五方面提供了一种桑黄饮品，由以下质量百分含量的组分组成：4-6％桑黄菌丝冻干粉、8-10％红柚浓缩汁、2-3％蜂蜜、3-5％果葡糖浆、0.01-0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3-0.5％、柠檬酸钠0.03-0.05％、果胶0.02-0.04％、0.05-0.09％黄原胶、食盐0.02-0.03％，余量为水。
本发明第六方面提供了桑黄菌丝体在饮品中的应用，所述应用具体方法为：
(a)将上述的所得的桑黄菌丝体，进行真空冷冻干燥，得桑黄菌丝体冻干粉；
(b)将步骤(a)中得到的桑黄菌丝体酶解液制备成桑黄饮品；所述桑黄饮品由以下质量百分含量的组分组成：4-6％桑黄菌丝冻干粉、8-10％红柚浓缩汁、2-3％蜂蜜、3-5％果葡糖浆、0.01-0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3-0.5％、柠檬酸钠0.03-0.05％、果胶0.02-0.04％、0.05-0.09％黄原胶、食盐0.02-0.03％，余量为水。
优选地，所述斜面培养基由以下质量百分含量的组分组成：1.8-2.0％玉米粉；2-2.5％葡萄糖；1.0-1.5％蛋白胨；1.8-2.0％琼脂；0.15-0.2％k2hpo4；0.08-1.2％mgso4；余量为水。
优选地，步骤(2)中，所述发酵培养基组成成分为：按质量百分比计，葡萄糖1.5％-2％，玉米粉2.5-3.0％，蛋白胨0.05％-0.1％，麸皮0.5％-0.8％，k2hpo40.15-0.2％；mgso40.03-0.08％，余量为水。
本发明中摇瓶培养所采用的培养基与发酵培养基的组分相同，即：所述摇瓶培养的培养基为：按质量百分比计，葡萄糖1.5％-2％，玉米粉2.5-3.0％，蛋白胨0.05％-0.1％，麸皮0.5％-0.8％，k2hpo40.15-0.2％；mgso40.03-0.08％，余量为水。
步骤(1)中，所述斜面培养为在将接种有桑黄菌种的斜面培养基在17-22℃条件下暗培养5-7d，待斜面长满菌丝体。
斜面培养基的配制方法为：称取定量玉米粉(粒度要求为20目-30目)，放入水中煮沸，文火15-20min，用双层消毒纱布过滤，补足水分至1000ml，将蛋白胨、琼脂、葡萄糖、k2hpo4、mgso4等加入，后将制备好的培养基趁热分装。
步骤(1)中，所述一级摇瓶培养条件为接入经过斜面培养的桑黄菌种1.5-2cm2，以150-200rpm转速，在20-30℃条件下，振荡培养9-15d，收集菌丝悬液。
步骤(1)中，所述二级摇瓶培养为将经过一级摇瓶培养的桑黄菌种与摇瓶培养基体积比为0.08-0.12的接种量接种到摇瓶培养基中，以150-200rpm转速，在25-30℃条件下，ph值为6.3-6.8，培养5-7d。
步骤(2)中，所述扩大培养为生产摇瓶二级种与发酵培养基体积比为0.1-0.16的接种量接种于发酵培养基中，控制罐温25-28℃，搅拌速度140-190rpm，通气量1:0.4-0.8v/v.min，发酵培养9-13d。
其中，上述一级摇瓶培养、二级摇瓶培养、发酵罐扩大培养所用的培养基组分与斜面培养的培养基组分大致相同，少了琼脂组分，即摇瓶培养基和发酵培养基的组分如下：葡萄糖1.5％-2％，玉米粉2.5-3.0％，蛋白胨0.05％-0.1％，麸皮0.5％-0.8％，k2hpo40.15-0.2％；mgso40.03-0.08％，余量为水。
本发明第七方面提供了一种桑饮品的制备方法，制备桑黄菌丝冻干粉，将各组分按比例添加，得含有桑黄菌丝体的饮品。
进一步地，制备上述桑黄饮品的制备方法，包含以下步骤：(1)将发酵一天的发酵液，放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的桑黄菌丝体，清洗过滤后的桑黄菌丝体，进行冻干；(2)冻干操作，设置参数为：预冻温度-40±2℃、预冻3-4h，二次预冻温度为-30℃±2℃、预冻2-3h；一次干燥温度45-48℃，干燥2-3h，二次干燥温度50-52℃，干燥5-6h，即得桑黄菌丝冻干粉。(3)将果葡糖浆、蜂蜜等用少量软水溶解过滤，然后分别加入桑黄菌丝冻干粉、热水溶化的果胶及黄原胶、柠檬酸、山梨酸钾搅拌均匀，加入红柚浓缩汁及其他配料，最后补水至配方规定的量。(4)将步骤(3)中得到的混合液进行均质研磨，均质为采用二级均质工艺，将料液预热至65-75℃，25-27mpa下均质处理10-15min，随后在15-20mpa均质压力下均质5-10min。采用二级均质工艺的主要目的在于进一步降低桑黄饮品中的粒径，使饮品体系更稳定，此外可以降低脂肪氧化的敏感性，且降低桑黄饮品的粒径可以有更强的风味和更好的口感，口感更佳细腻。(5)将步骤(4)中的混合料在100℃下杀菌10min，以破坏或杀灭致病及其他不良的微生物，精滤后得澄清透明的酶解滤液，以提高产品细腻度；(6)将定容后的料液加热至沸，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶、压盖后105℃下杀菌10min、冷却后得桑黄饮品。
除非另有说明，本发明所述“％”为质量百分浓度。
有益效果：(1)本发明通过对桑黄培养基的改进和培养方法的改进，进行液体深层发酵及摇床培养得到桑黄菌丝体，此方法易于控制，易于大量获得桑黄菌丝体。(2)本发明将清洗过滤后的菌丝体经冻干后，加入其它辅料，混合液均质后，经过灭菌，得到菌丝发酵饮品，在处理过程中，采用冻干方式对桑黄菌丝进行处理，其营养成分和活性物质得到保留。(3)本发明的桑黄菌丝发酵饮品，在保留桑黄菌丝原有的保健功效的基础之上，添加浓缩红柚汁，使桑黄饮品的营养更加丰富，风味独特，口感更加细腻，减少了饮品在后期贮藏过程中的分层、褐变等现象。
具体实施方式
一、原料来源
1.1桑黄菌种由江苏食用菌研究所所提供；
1.2黄原胶、果胶等购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；
1.3浓缩红柚汁、蔗糖等为市售食品级；
1.4其余材料均市购所得。
二、检测方法
2.1感官评定
取试样置于烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态。闻其气味，用温开水漱口，品尝滋味。感官品质得分为3个指标总和。感官评价由20位具有品评经验的食品专业同学进行评价，取其平均值。
外观(10-30分)：细腻润滑，组织连贯均一，无结块和分层、无固体析出、色泽一致，无沉淀。
口感(10-40分)：口感爽滑，口味醇厚。
风味(10-30分)：饮品的酸甜度适中、饮品香气浓厚，独特饮品酵香。
表1桑黄菌丝饮品l9(34)试验因素与水平
2.2桑黄饮品稳定性测定
2.2.1观察一周，测定析出水层的高度lw和样品总高度ls，lw/ls以来表示自然分层比，值越小稳定性越好。
2.2.2离心沉淀率口将放置一段时间的饮料摇匀，加入样品于离心管的3/4处，然后在2500r/min下离心8min，再弃去上部溶液,准确称取沉淀物重，利用式一计算离心沉淀率。
w＝m2-m1/m0-m1*100％
w：离心沉淀率；
m1：一用于装离心液体的塑料壳重，g；
m2：离心后，除去上清液时的壳重与沉淀总重，g；
m0：离心前液体与壳体总重，g。
2.3桑黄菌丝体鲜重测定方法
桑黄菌丝体发酵液，采用100目筛网过滤，将菌丝体用蒸馏水冲洗数次，沥干，称重后，即得桑黄菌丝体鲜重。
三、桑黄菌丝球冻干粉制备
实施例1：桑黄菌接种到斜面培养基上，斜面培养基组分为1.8％玉米粉；2％葡萄糖；1.0％蛋白胨、2.0％琼脂、0.2％k2hpo4、0.08％mgso4、余量为水。在黑暗中20℃条件下培养数7d，待斜面长满桑黄菌丝，将桑黄菌种接种到摇瓶培养基中，进行一级摇瓶培养，得到生产摇瓶一级种，培养条件为摇瓶培养基与摇瓶的体积比为200:1000ml/ml，摇瓶培养基的组分葡萄糖2％，玉米粉3.0％，蛋白胨0.05％、麸皮0.5％、k2hpo40.2％、mgso40.05％，余量为水，接入1.5cm2的经斜面培养的菌种，150rpm振荡培养7d，温度20℃；将经过一级摇瓶培养桑黄菌种与摇瓶培养基按体积比为0.12:1进行接种，进行二级摇瓶培养，按上述一级摇瓶培养基和培养条件，再次扩大培养5d，得到生产摇瓶二级种。生产摇瓶二级种转接入装有发酵培养基的种子罐进行扩大培养得到发酵一级种，培养条件为接种量与发酵培养基的体积比为0.1:1，控制罐温25℃，搅拌速度150rpm，通气量1:0.4v/v.min，发酵培养10d；按种子罐扩大培养所述的发酵培养基和培养条件，将发酵一级种转接入装有发酵培养基的发酵罐培养，发酵一天放罐，发酵醪料经过滤，得新鲜的桑黄菌丝球。
采用南京先欧xo-100f型真空冷冻干燥机，设置预冻温度-40±2℃、预冻4h，二次预冻温度为-30℃±2℃、预冻3h；一次干燥温度46℃，干燥3h，二次干燥温度50℃，干燥6h，即得桑黄菌丝冻干粉。
四、桑黄饮品的制备
样品1：6％桑黄菌丝冻干粉、2％蜂蜜、4％果葡糖浆、10％红柚浓缩汁，25mpa下均质处理15min，随后，在20mpa均质压力下均质10min，均质后补水至100％。再将热水溶化后的果胶及黄原胶(0.04％+0.09％)、柠檬酸及柠檬酸钠(0.5％+0.05％)、0.01％山梨酸钾、0.02％食盐等加入，将料液预热至70℃，26mpa下均质处理10min，随后在20mpa均质压力下均质10min，搅拌均匀后，控制脱气真空度为0.06mpa，脱气25min，脱气完成后加热料液至沸保持10min，趁热加灌入已灭菌的饮料瓶、压盖后105℃下杀菌10min、冷却后得桑黄菌丝发酵饮品。
样品2：5％桑黄菌丝冻干粉、9％红柚浓缩汁、2％蜂蜜、4％果葡糖浆、0.01％山梨酸钾、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.03％、0.03％果胶、0.06％黄原胶、食盐0.02％，制备方法同样品1。
样品3：5％桑黄菌丝冻干粉、9％红柚浓缩汁、3％蜂蜜、5％果葡糖浆、0.015％山梨酸钾、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.03％、0.02％果胶、0.07％黄原胶、食盐0.03％，制备方法同样品1。
样品4：5％桑黄菌丝冻干粉、10％红柚浓缩汁、2％蜂蜜、4％果葡糖浆、0.011％山梨酸钾、柠檬酸0.4％、柠檬酸钠0.04％、0.03％果胶、0.07％黄原胶、食盐0.03％，制备方法同样品1。
五、样品理化性质测定
5.1桑黄菌丝发酵饮品调配正交试验结果分析
表2桑黄菌丝发酵饮品调配l9(34)试验因素与水平
从表2桑黄菌丝发酵饮品调配工艺的正交试验结果中的r值可知，影响其综合评分的因素主次顺序为a＞c＞b＞d，即桑黄菌丝冻干粉添加量＞柠檬酸+柠檬酸钠＞红柚汁+果葡糖浆＞果胶+黄原胶。依据综合评分的结果分析可知，优化的工艺组合均为a2b2c3d1，即桑黄菌丝冻干粉的添加量为5％，红柚汁9％与4％果葡糖浆及柠檬酸0.5％+柠檬酸钠0.05％，果胶0.04％及黄原胶0.09％。外观、口感及风味的综合值均保持在最高。
六、结果测定
表3样品检测结果
对样品进行性能测定，结果见表3。由表3的结果可以看出，按照不同设定比例对桑黄进行离心沉淀的检验及感官评分，表明在适宜的添加比例当中，离心沉淀率及感官差异不显著，证明在实际操作中，此桑黄菌丝饮品的产品在保证口感的同时，稳定性较高。