一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法与流程

本发明属于植物细胞工程技术领域，具体涉及一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法。

背景技术：

我国是棉花种植和消费大国，总产量已居世界之首。棉花是重要的经济作物，其涉及的产业链长，行业从事人员广，棉花的生产关乎到社会经济生活的诸多方面。

棉花的高产优质是育种工作者们不断追求的目标，经过几代人的不懈努力，目前棉花在产量和质量上都有了极大地提高，想进一步发展难度较大；同时由于棉花的生长周期长，整个周期内会遭受各种不良环境，多种病虫草害的影响，对棉花的产量品质等的影响极大。限于棉花的种质资源有限，单纯依靠常规育种很难解决上述问题。

基因工程作为一种改造植物的手段后，使通过遗传转化方法“定向改造”棉花性状成为了可能，更为种质资源的创新开辟了新的途径。目前对棉花开展的相关方面的研究多是以植物组织培养技术的基础通过农杆菌介导的棉花外植体来实现的。

通过体细胞胚胎发生途径再生是棉花组织培养的主要方式，但是棉花是一类难以进行组培的作物，实验的成功与否对试材的基因型依赖极强，培养周期长、培养过程繁琐、胚状体发生效率低等都是这一途径的困难。拓宽可进行组培再生及遗传转化的棉花品种数量以及建立高效的再生体系是顺利开展棉花遗传转化工作的必要前提。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，为提高棉花体细胞胚胎发生效率提供了一种有效的方法，具有一定的社会效益和经济效益，对我国棉花产业发展有一定的贡献。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，包括下述步骤：

(1)选取棉花种子，去除种皮；

(2)无菌苗培养：将步骤(1)的去除种皮后的棉花种子消毒，并接种至无菌苗培养基，进行无菌苗培养，培养过程为，于接种培养2天后将萌发的胚根插入无菌苗培养基中扶苗，扶苗之后继续培养4天得到无菌苗，此过程均于28℃恒温暗培养；

(3)愈伤组织诱导和胚性愈伤组织诱导：取步骤(2)无菌苗培养得到的无菌苗，切掉子叶和胚根，下胚轴切为0.6-0.8cm茎段并接种于愈伤组织诱导培养基，进行愈伤组织诱导和胚性愈伤组织的诱导，此过程，于28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天，每隔30天继代培养一次，直至分化获得胚性愈伤组织；

(4)胚性愈伤组织的增殖：将步骤(3)得到的刚分化的胚性愈伤组织接种至含终浓度0.5mg/liba和0.1mg/lkt的固体msb培养基上，生长得到淡黄色疏松胚性愈伤组织后将其转移至含终浓度1g/lnacl、0.5mg/liba和0.1mg/lkt的液体msb培养基上，28℃震荡悬浮光照培养5天完成增殖，光照时间为14小时/天；

(5)基于外源腐胺固液交替培养的胚状体分化调控：将步骤(4)的悬浮培养物过筛，将过筛后的培养物进行沉淀，倒弃沉淀后的上清液，于沉淀中再重新加入少量液体msb培养基重悬，重悬后接种至胚状体分化调控培养基，进行胚状体分化，此过程，于28℃恒温光照培养，培养时间为4周，光照时间为14小时/天；

(6)生根培养：将步骤(5)培养可见明显子叶的成熟胚状体转移至生根培养基中，于28℃恒温光照培养，进行生根培养，光照时间为14小时/天；

(7)驯化与移栽：将步骤(6)中长出发达根系的植株进行水培炼苗，驯化后移栽至营养土钵中继续生长，此过程，于28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天；

其中，所述步骤(5)中，胚状体分化调控培养基为去掉nh4no3，且kno3含量加倍，并含终浓度0.5mg/liba、0.1mg/lkt和1mm腐胺的msb培养基。

进一步地，所述步骤(2)中，消毒过程为先使用0.1％升汞消毒10分钟，后用无菌水冲洗3-4次。

进一步地，所述步骤(2)中，无菌苗培养基为仅含减半大量元素的msb培养基。

进一步地，所述步骤(3)中，愈伤组织诱导培养基为含终浓度0.1mg/l2,4-d和0.1mg/lkt的msb培养基。

进一步地，所述步骤(6)中，生根培养基为无机物含量减半，有机物含量不变的1/2msb培养基。

进一步地，所述msb培养基为改良的msb培养基，由ms的无机盐成分和b5培养基的有机成分组成，msb培养基具体组成如下：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l、葡萄糖30g/l、植物凝胶2.5g/l，ph为5.8～6.0。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明结合固液交替培养，先将胚性愈伤组织在液体培养基中悬浮培养，加快愈伤增殖速度，有利于快速获得大量胚性愈伤组织，固体培养基上的胚状体发生有利于成熟子叶胚的发育。

(2)本发明调控胚状体分化时通过在固体培养基中加入1mm腐胺显著地促进了胚性愈伤组织的增殖和胚状体的分化。

(3)本发明中使用的基本培养基是改良的msb培养基，通过改善了有机物成分促进再生植株根的发育，有利于获得更多的正常再生植株。

附图说明

图1为本发明实施例中正常处理条件下(对照)的棉花胚性愈伤增殖与分化；

图2为本发明实施例中加入put处理(腐胺处理)的棉花胚性愈伤增殖与分化；

图3为本发明实施例中对照与put处理(腐胺处理)后胚性愈伤生长量比较；

图中，ck为对照，put为腐胺处理；

图4为本发明实施例中对照与put处理(腐胺处理)后单位重量愈伤中胚状体数目比较；

图中，ck为对照，put为腐胺处理；

图5为本发明实施例中对照与put处理(腐胺处理)后单位重量愈伤中子叶胚数目比较；

图中，ck为对照，put为腐胺处理；

图6为本发明实施例中对照与put处理(腐胺处理)后子叶胚占胚状体比率比较；

图中，ck为对照，put为腐胺处理。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中，无机盐购自国药集团化学试剂有限公司和北京化学试剂公司；2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-d)、吲哚丁酸(iba)萘乙酸(naa)、激动素(kt)、植物凝胶和维生素购自sigma公司；肌醇购自国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖购自北京北化精细化学品有限责任公司。

实施例

通过腐胺和固液交替培养提高棉花胚状体发生效率的方法，实验步骤如下：

新疆棉花品种新陆早33号种子去除种皮，0.1％升汞溶液中消毒10分钟，无菌水清洗3至4次，接种于无菌苗培养基，28℃的恒温培养箱中暗培养6天。

无菌苗取出，切掉胚根和子叶部分，下胚轴切成0.6-0.8cm的茎段，接种于愈伤组织诱导培养基上，每皿放20个左右的茎段，然后用parafilm膜封口。28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天。愈伤组织诱导培养基为附加有0.1mg/l2,4-d和0.1mg/lkt的msb培养基。采用高压蒸汽灭菌，灭菌时间为15～20min。

诱导培养基为改良的msb培养基附加植物激素组成，msb基本培养基组成为：硝酸钾1.9g/l、硫酸铵1.65g/l、磷酸二氢钾0.17g/l、七水硫酸镁0.37g/l、二水氯化钙0.44g/l、四水硫酸锰22.3mg/l、硼酸6.2mg/l、七水硫酸锌8.6mg/l、碘化钾0.83mg/l、二水钼酸钠0.25mg/l、五水硫酸铜0.025mg/l、六水氯化钴0.025mg/l、乙二胺四乙酸钠37.3mg/l、七水硫酸亚铁27.8mg/l、甘氨酸2mg/l、烟酸1mg/l、盐酸硫胺素10mg/l、盐酸吡哆醇1mg/l、肌醇100mg/l，葡萄糖30g/l、植物凝胶2.5g/l，ph为5.8～6.0。

愈伤诱导培养基30天更换一次，继代直至胚性愈伤组织产生，将诱导产生的胚性愈伤组织增殖培养1-2代：先将胚性愈伤组织转移至含终浓度0.5mg/liba和0.1mg/lkt的固体msb培养基进行增殖培养，生长得到淡黄色疏松胚性愈伤组织后接种至含终浓度1g/lnacl以及0.5mg/liba和0.1mg/lkt的液体msb培养基中，28℃振荡悬浮光照培养5天完成增殖，光照时间为14小时/天。

将悬浮培养物通过50目钢筛过筛，将过筛后的培养物沉淀后倒出上清液，重新加入少量新鲜液体培养基重悬，重悬后接种到胚状体分化调控培养基。胚状体分化调控培养基为去掉nh4no3，kno3加倍的msb培养基，同时附加0.5mg/liba和0.1mg/lkt，设置对照和加入1mm腐胺的处理。28℃恒温光照培养，光照时间为14小时/天。

培养4周后，培养可见明显子叶的成熟胚状体，加入腐胺处理后愈伤增殖和分化明显增强(图1～2)，此后统计培养物生长量、胚状体和子叶胚数目以及子叶胚占胚状体比率，发现腐胺处理后生长量达到0.069g/天，单位重量培养物中胚状体和子叶胚数目分别达到19.75个/g和14.51个/g，子叶胚占胚状体比率达到73％；较对照分别提高13.41％，36.87％，120.59％和69.77％，均表现出显著和极显著的提高(图3～6)，表明1mm的腐胺对于胚性愈伤组织增殖和胚状体分化均有明显的促进作用。将诱导产生的成熟胚状体转移至生根培养基中，28℃光照条件(2000lux)下进行生根培养，长出发达根系后进行水培炼苗，驯化后移栽至营养土和蛭石(3:1)混拌的土钵中。光照培养的光照时间为14小时/天。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而作出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围。