本发明属于梨树抗病育种技术领域，具体是一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法。
背景技术：
库尔勒香梨是国家地理标志产品，荣获中国驰名商标，原产地分布仅为新疆巴州、阿克苏地区，面积80余万亩。自2017年发生苹果枝枯病以来，迅速扩散蔓延，造成大量树死园毁，严重威胁新疆香梨生产和生态安全，已成为香梨毁灭性的植物细菌性病害。香梨及其常规砧木杜梨均为高度感病品种，病原侵染到砧木杜梨后，迅速扩散到整个根系，导致根系皮层组织褐变坏死，造成整株梨树快速死亡。据政府部门的数据，2018年当年新疆巴州地区香梨死亡株数达179万株，2019年当年新增香梨死亡株数达23万株，2018和2019年减产幅度超过50％，香梨产业遭受重创。梨苹果枝枯病抗性等级分为高抗、中抗、感病、易感4个等级，选育高抗苹果枝枯病杜梨砧木资源成为解决香梨苹果枝枯病的根本途径之一。
关于果树抗病育种的研究约已有100余年的历史。19世纪中叶，美国开始了西洋梨抗火疫病（erwi-niaamylovora）育种。当时从中国引进沙梨进行种间杂交，育成康德、贵妃和嘉宝等品种，虽然品质不够好，但比西洋梨品种抗病。这些品种栽培不久，美国就开始了抗病、优质的梨育种工作。与此同时，包括苹果黑星病（venturiainaequalis）在内的其它果树主要病害的抗性育种也陆续分别开始。到20世纪50年代以后，抗病育种的对象已有苹果、梨、桃、葡萄、核桃、栗、榛、醋栗、草莓、柑橘等10余种果树30余种病害。其中研究时间长，收效显著的要数苹果黑星病和梨火疫病抗性育种。中国的果树抗病育种是在20世纪70年代末，中国农业科学院果树研究所才正式开始梨的抗黑星病育种。
长期以来，果树抗病育种主要育种途径是通过引种，实生选种、芽变选种、辐射育种等方法虽然也可获得抗病品种，但目前集中研究的主要还是杂交育种。通过杂交育种可以把不抗病品种的优良品质与抗病品种的抗性结合起来，为世界各国所重视。经育成的抗病品种和砧木，除抗苹果黑星病的prima和pricilla（美国）外，主要有抗梨火疫病的格鲁摩苏、月光、曙光（美国），斯塔尔（star）（英国），抗梨黑星病的新世纪（日本），抗樱桃小果病的salmo（加拿大）、抗栗病的clapper（美国）以及柑橘砧木耐疫菌的sampson橘柚和枳壳杂种troyer和carrio枳橙（美国）。由于育成一个理想的抗病果树新品种，往往需要好几个育种世代，甚至可延续几十年以至上百年，因此往往要求制定一个长远的、精密的计划。
近年来发生的苹果枝枯病是一种传染性强、死树率高的植物细菌性病害，由于能在短期内对香梨树造成毁灭性危害，采用现有技术中的常见抗病育种方法效率太低，难以保证育种的高抗性和可行性，不适用于高抗病香梨砧木的育种需求，无法实现高抗苹果枝枯病香梨砧木品种的快速高效育种。
另一方面，在现有技术中，由于苹果枝枯病的菌种额传染性强、病死率高，以及其寄主、环境等方面的复杂影响，目前在世界范围内关于高抗苹果枝枯病砧木的育种研究鲜有报道。
综上所述，为挽救我国的香梨产业，迫切需要一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法。
技术实现要素：
本发明针对常规香梨病害防控技术仅能延缓病情发展程度、难以解决严重病害香梨树大面积死亡的重大难题，提出了一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法，突破性地选育出高抗苹果枝枯病的香梨砧木。
将本发明筛选的高抗苹果枝枯病的香梨砧木与优选的高抗苹果枝枯病接穗进行桥接，能够抚育出高抗苹果枝枯病的香梨新树体，从而实现病害香梨树的成功救治或者高抗苹果枝枯病香梨树重新栽植。
本发明涉及的梨种质遗传资源有香梨砧木资源和香梨接穗资源，均源自库尔勒香梨主产地，即新疆巴州库尔勒市、尉犁县、轮台县。
本发明提供的技术方案是：一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法，包括以下步骤：
（1）收集香梨砧木种子：收集适合新疆种植的香梨砧木资源的种子作为供试筛选对象，在田间收集发生遗传性状变异的单株果实，取出种子，保存待用；
（2）种子沙藏处理：将步骤（1）所得砧木种子清水浸泡24～36h，混合3倍体积的河沙，河沙持水量保持70%左右，在0℃～4℃范围内保存45～50天；
（3）温室育苗：将步骤（2）所得砧木种子在温室内育苗，温度≥10℃开始播种，抚育幼苗生长，苗高平均30～40cm时进行接种，每个预选品种培育实生苗≥100株；
（4）菌株保存：将经过准确鉴定和致病力测定的苹果枝枯病病原菌株在nb培养基上培养24～48hr时，离心去除上清液，加30%甘油并保存于-70℃或-20℃冰箱中；
（5）制备菌液：蘸取步骤（4）所得的菌株在na培养基上划线，置于28℃生化培养箱中活化培养24～48hr；将菌株活化后，在na培养基上挑取单菌落在nb培养基中，置于28℃，在150rpm振荡培养箱中培养24～48hr；现配现用；
（6）针刺法人工接种：将新鲜菌液配制成浓度为1×105cfu/ml的接种菌液，使用一次性5ml注射器针头经消毒后吸入配制好的菌液，在幼苗顶端下第3叶片叶腋处针刺，刺破表皮并从注射器中挤出一小滴菌液；每次处理35株；
（7）幼苗一次筛选：人工接种1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，余下的幼苗继续观察和评价；
（8）幼苗二次筛选：将经过步骤（7）一次筛选保留的幼苗，使用浓度1×108cfu/ml的接种菌液二次接种，接种后1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，将余下幼苗移植大田，初步得到高抗苹果枝枯病的香梨砧木幼苗。
本发明的还包括的优化或/和改进有：
优选方案之一，步骤（1）所述香梨砧木资源的种子包括杜梨、酸梨、豆梨、秋子梨和新疆本地梨等品种。
进一步的，步骤（1）所述香梨砧木资源的种子是杜梨种子。
优选方案之二，步骤（1）所述发生遗传性状变异的单株是指遗传特征表现特异性的单株，包括枝条无刺类型、大果类型及果实表皮颜色改变的类型。
实施本发明的关键点在于：
1、确定拟选育香梨砧木品种和表现特异性遗传特征的遗传资源收集，供试材料的针对性是必要的，在适合做香梨砧木的基础上选育抗病品种。杜梨等新疆本地梨特异性品种资源的收集，尤其在发病区，经过自然筛选，以及病原菌和寄主协同进化时，是发现抗性选育种质资源的希望所在。
2、制备本发明提出的标准菌液。接种用的标准菌株是经过准确鉴定和致病力测定的菌株，具有综合的高致病力，确保人工接种效果。
3、在温室培育幼苗进行人工接种，严格按照接种操作规范执行，温室幼苗必须经过二次接种和筛选。
本发明的创新点和有益效果主要有：
1、在果树病害治理领域，病菌接种方法常用于病害的评估试验方面，本发明创造性地将病菌接种方法运用到高抗苹果枝枯病性状香梨砧木的筛选方法中，即通过在拟选育的供试香梨砧木实生苗上进行人工接种试验，根据病原侵染后的症状表现，判定不同种质资源的抗病性，经过温室幼苗一次筛选和强化接种后的温室幼苗二次筛选，最终选育出高抗苹果枝枯病的香梨砧木品种幼苗。
2、本发明制定了高抗病香梨砧木选育初步方法，制定了标准试验流程和技术操作规范，具有很强的可操作性，可以广泛应用到不同梨品种的抗苹果枝枯病的砧木幼苗筛选。
3、采用本发明的高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法，具有很高的可行性和可靠性，为下一步田间抗病砧木的筛选提供了有价值的供试幼苗，是抗病砧木品种选育的基础工作，对防治香梨苹果枝枯病具有重要的意义和作用。
下面结合实施例详细说明本发明的技术方案。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步地详细描述。
实施例1：2018年库尔勒某县农户果园大面积爆发严重的苹果枯枝病，首先，采用了本发明一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法提前2年进行了抗病砧木幼苗筛选，步骤如下：
（1）收集香梨砧木种子：收集适合新疆种植的香梨砧木资源杜梨的种子作为供试筛选对象，在田间收集发生遗传性状变异的单株果实，取出种子，保存待用；
（2）种子沙藏处理：将步骤（1）所得砧木种子清水浸泡24～36h，混合3倍体积的河沙，河沙持水量保持70%左右，在0℃～4℃范围内保存45～50天；
（3）温室育苗：将步骤（2）所得砧木种子在温室内育苗，温度≥10℃开始播种，抚育幼苗生长，苗高平均30～40cm时进行接种，每个预选品种培育实生苗≥100株；
（4）菌株保存：将经过准确鉴定和致病力测定的苹果枝枯病病原菌株在nb培养基上培养24～48hr时，离心去除上清液，加30%甘油并保存于-70℃或-20℃冰箱中；
（5）制备菌液：蘸取步骤（4）所得的菌株在na培养基上划线，置于28℃生化培养箱中活化培养24～48hr；将菌株活化后，在na培养基上挑取单菌落在nb培养基中，置于28℃，在150rpm振荡培养箱中培养24～48hr；现配现用；
（6）针刺法人工接种：将新鲜菌液配制成浓度为1×105cfu/ml的接种菌液，使用一次性5ml注射器针头经消毒后吸入配制好的菌液，在幼苗顶端下第3叶片叶腋处针刺，刺破表皮并从注射器中挤出一小滴菌液；每次处理35株；
（7）幼苗一次筛选：人工接种1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，余下的幼苗继续观察和评价；
（8）幼苗二次筛选：将经过步骤（7）一次筛选保留的幼苗，使用浓度1×108cfu/ml的接种菌液二次接种，接种后1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，将余下幼苗移植大田，初步得到高抗苹果枝枯病的香梨砧木幼苗。
然后，采用本实施例得到的高抗抗苹果枝枯病的香梨砧木种苗对病死香梨树进行的救治改造，按以下步骤实施：
a.培育容器大苗：在温室或大棚内，采用直径25～30cm，深度30～35cm的种植袋，配置营养土，抚育筛选的砧木种苗，经2年出圃，得到高抗苹果枝枯病的梨树砧木容器大苗；
b.主树行侧定植：以待救治的、患苹果枝枯病的香梨树作为主树，在3月下旬至6月中旬或11月上、中旬土壤上冻前，将步骤a所得的容器大苗运到田间，并在主树行内两侧距主树50～70cm处的圆形栽植穴内栽植；
c.砧木种苗塑形：将步骤b所得的行侧定植种苗进行修剪塑形，并预留适合嫁接的部位及分枝1～3个；
d.砧木种苗桥接：以恢复正常生长状态的定植砧木种苗与主树进行桥接，桥接时间为3月下旬至7月中旬，当年春季定植的砧木种苗5月下旬至6月下旬嫁接；
e.桥接后管理：嫁接45天后切开薄膜检查嫁接口，如出现愈伤组织，则继续保留薄膜，必要时用胶带固定，90天后去除薄膜，喷施或涂抹保护剂防止嫁接口病虫危害；如未出现愈伤组织，重新进行步骤d的砧木种苗桥接；桥接成活后去除砧木种苗的多余分枝，保证充足的养分促进生长。
本实施例所在果园已取得良好救治效果，患苹果枝枯病香梨树的成活率目前达到85%以上。
实施例2：2017年新疆轮台县农户果园大面积爆发严重的苹果枯枝病后，大部分香梨树死亡，重新种植时。首先采用了本发明一种高抗苹果枝枯病的香梨砧木的初选方法提前2年进行了抗病砧木幼苗筛选，步骤如下：
（1）收集香梨砧木种子：收集适合新疆种植的香梨砧木资源杜梨的种子作为供试筛选对象，在田间收集枝条无刺类型、大果类型及果实表皮颜色改变类型等发生遗传性状变异的单株果实，取出种子，保存待用；
（2）种子沙藏处理：将步骤（1）所得砧木种子清水浸泡24～36h，混合3倍体积的河沙，河沙持水量保持70%左右，在0℃～4℃范围内保存45～50天；
（3）温室育苗：将步骤（2）所得砧木种子在温室内育苗，温度≥10℃开始播种，抚育幼苗生长，苗高平均30～40cm时进行接种，每个预选品种培育实生苗≥100株；
（4）菌株保存：将经过准确鉴定和致病力测定的苹果枝枯病病原菌株在nb培养基上培养24～48hr时，离心去除上清液，加30%甘油并保存于-70℃或-20℃冰箱中；
（5）制备菌液：蘸取步骤（4）所得的菌株在na培养基上划线，置于28℃生化培养箱中活化培养24～48hr；将菌株活化后，在na培养基上挑取单菌落在nb培养基中，置于28℃，在150rpm振荡培养箱中培养24～48hr；现配现用；
（6）针刺法人工接种：将新鲜菌液配制成浓度为1×105cfu/ml的接种菌液，使用一次性5ml注射器针头经消毒后吸入配制好的菌液，在幼苗顶端下第3叶片叶腋处针刺，刺破表皮并从注射器中挤出一小滴菌液；每次处理35株；
（7）幼苗一次筛选：人工接种1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，余下的幼苗继续观察和评价；
（8）幼苗二次筛选：将经过步骤（7）一次筛选保留的幼苗，使用浓度1×108cfu/ml的接种菌液二次接种，接种后1个月内，将病斑长度扩展超过幼苗高度25～30%的幼苗淘汰，将余下幼苗移植大田，初步得到高抗苹果枝枯病的香梨砧木幼苗。
然后进行了高抗苹果枝枯病的香梨树体的栽植、抚育，实施步骤为：
a.筛选抗病种苗：将前述初选得到的具有高抗苹果枝枯病的杜梨类型作为目标种苗移入大田进行繁殖，经过2年培育，筛选出达到一级杜梨种苗标准的抗病种苗；
b.开挖植树穴：秋季或春季植树季节，在规划好的地块，顺行方向开挖长形种植穴；所述植树穴长60～80cm、宽35～40cm、深40～50cm；如土壤贫瘠或是生荒地，加大种植穴30～60%并填放适量充分腐熟的厩肥或油渣；
c.定植种苗：备好的苗木按一穴3苗沿植树穴展开均匀排列，选最大的树苗为主苗栽植在穴中央，两边的树苗为辅苗紧靠植树穴两头，顺行排齐，种苗根系入土，培土踩实；苗木用生根粉浸泡处理后栽植；
d.种苗塑形：在砧木实生苗生长过程中进行整形修剪，主苗、辅苗修剪塑形方法不同，主苗80cm高度定干，保留4～5个不同方向的分枝，剪口下最近的分枝培育为中心干；辅苗不定干，保留朝向主苗的分枝1～3个，剪去其余方向的分枝；
e.种苗桥接：适时将辅苗桥接到主苗上，辅苗枝条桥接到主苗的主干或主枝部位上，桥接枝条的嫁接部位以直径0.5cm为宜，主、辅苗之间桥接1～3次；桥接在生长期可多次进行；所述种苗桥接的操作方法是：（a）两个拟桥接枝条直径0.5cm左右；（b）桥接的两个枝条位置较近或交叉生长；（c）拟桥接的两个枝条朝向必须都向上或方向基本一致，相对生长的枝条不能桥接；（d）桥接选用靠接手法，两个枝条的嫁接处，用利刃或刀片在相向的一面，切出长1.0cm左右的平面，两端纵向切齐，深度不超过枝条直径的三分之一，大小一致，相互贴合，用塑料薄膜扎紧，从嫁接处剪去辅苗枝条；（e）优先在主苗的主干上进行桥接，辅苗上其他适合的嫁接部位也可以在主苗的主枝上桥接；（f）主苗和辅苗之间桥接以2～3处为宜，长势健壮的辅苗，只要桥接条件适合，亦可多处桥接；（g）主苗和辅苗之间桥接及主苗上嫁接香梨接穗没有先后次序之分，可以同时或交叉进行，只要生长到适合嫁接的程度即可；（h）桥接整个生长季节都可以进行操作，以春季树芽萌动时为宜；
f.优选香梨接穗：在苹果枝枯病的重病区及发生严重病害的香梨园，选择无发病症状或轻度发病、枝干完整不缺，并且树势健壮、连年座果率高、果形好的成龄香梨树进行标记，作为采穗母树；冬剪时采集穗条保存待用；
g.嫁接香梨接穗：按照培育实生干梨树的方法在砧木种苗上对步骤f所得的优选香梨接穗进行多头嫁接，以3月中下旬树芽萌动时为宜；采用的多头嫁接方法是：（1）砧木苗定植：按照香梨育苗标准使用杜梨砧木苗定植；（2）接穗采集和贮藏：采集接穗的母树为树势强健、丰产质优无病虫害的中年香梨树；选用生长充实的一年生外围粗壮发育枝或结果枝，在冬季或早春采集接穗，蜡封接穗后于低温下保湿贮存，至嫁接时取出；或从上述条件的母树树冠外围部位，选取叶芽饱满的当年生的发育枝，作为芽接材料；（3）实生干培育：砧木苗定干高度1.5～1.8m，第一层分枝留在50～80cm，留3～5个不同方向、螺旋上升的分枝；第一层分枝以上的中心干上每隔30～35cm留一组3～4个不同方向的分枝，直至定干处，剪去多余的分枝；当分枝直径达到0.5cm以上时即可进行嫁接；（4）选择嫁接方式及时间：在春季用枝接方式嫁接，芽接时期可在春、夏、秋三季，凡皮层可以剥离时均可进行，实生干上所留用的分枝达到粗细要求时分次进行嫁接操作；（5）实施嫁接操作：（a）取出贮藏的接穗，截成留有2～3个饱满芽的枝段待用；（b）春季枝接时，要求接穗上的芽在向下或侧面的位置；（c）夏、秋季芽接时，要求嫁接在枝条的背下处；（6）接穗成活后，培养接穗背下发出的、斜上生长的新梢，摘除接穗背上发的新梢，避免形成直立向上枝条；接穗未成活的，下一嫁接时段再次实施嫁接操作；（7）嫁接成活以后，去除薄膜，在嫁接口喷施保护剂防止病虫危害，实施2～3次，两次之间间隔15～20天；（8）嫁接后应实施培育保护措施；
h.嫁接后管理：在步骤e种苗桥接和步骤g嫁接香梨接穗后需进行嫁接后管理，包括：嫁接45天后切开薄膜检查嫁接口，出现愈伤组织，则继续保留薄膜，必要时用胶带固定，90天后去除薄膜，喷施或涂抹3～4次保护剂防止嫁接口病虫危害，每次间隔15～25天；如未出现愈伤组织，重新进行嫁接；嫁接成活后，去除种苗多余的分枝，加强水肥管理，保证充足的养分促进生长。
本实施例所在果园已取得良好防治效果，患苹果枝枯病香梨树的发病率低于8%，未发生其他病害和冻害，新建的香梨园建园周期缩短2年。