一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法与流程

本发明属于虫草培育技术领域，涉及一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法。

背景技术：

新疆虫草，又称细虫草、新疆黑槌虫草、阿尔泰虫草等，是新疆虫草菌ophiocordycepsgracilis寄生在阿尔泰蝠蛾hepialusaltaicola幼虫或者蛹上后，形成的虫菌复合体。因为新疆虫草菌与冬虫夏草菌ophiocordycepssinensis隶属于同一个属；同时，新疆虫草的寄主昆虫——阿尔泰蝠蛾，与冬虫夏草的常规寄主昆虫——虫草蝠蛾hepialusarmoricanus也隶属于同一个属，所以新疆虫草是替代冬虫夏草的良好候选药材之一。阿尔泰蝠蛾，为新疆特有种昆虫，仅分布于新疆的阿尔泰山，所以新疆虫草主产于新疆阿尔泰山。新疆虫草为新疆传统的哈萨克民族药，其成分和主要功效与冬虫夏草基本相同，已列入新疆维吾尔自治区药品标准(赵恒和屈新兰，2000)，与冬虫夏草同等使用，但价格不及冬虫夏草的十分之一，具有一定的价格优势。

目前，对于新疆虫草的研究大多集中在虫草菌的分离培养，虫草菌的成分含量和药用价值等方面；李春如等（2006，十七种虫草的子实体培育研究）曾尝试过培育新疆虫草（文中称细虫草）ophiocordycepsgracilis的子实体，但是以失败告终，目前尚未有能人工诱导新疆虫草菌产生子实体的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法，该方法有利于加快新疆虫草的人工培育，降低成本，适合推广应用。

其具体技术方案为：

一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法，包括以下步骤：

步骤1.固体培养基的制备：固体培养基的配方为：葡萄糖20g/l、新鲜马铃薯200g/l(去皮、切碎、煮沸30min、纱布过滤取上清)、蛋白胨10g/l、酵母粉10g/l、mgso4·7h2o0.07g/l、kh2po40.7g/l、琼脂18g/l。先将固体培养基，121℃蒸汽灭菌20min后，在超净工作台内倒入90mm无菌培养皿中，每皿18ml，冷却备用。同时，将上述培养基，配制于500ml塑料组培瓶中，每瓶150ml，以及100ml玻璃锥形瓶中，每瓶30ml，然后121℃蒸汽灭菌20min后，冷却后备用。

步骤2.在超净工作台中，将野外采集到的新鲜新疆虫草，清除表面泥土和杂物，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭过菌的单面刀片，切去虫草表皮，避开其寄主的消化道，再切取约0.2-0.6cm长的新疆虫草菌段，接种于培养皿中的固体培养基上。

步骤3.将培养皿在16-20℃、避光、40-70%rh条件下培养6-15天。此时，在接种的菌段上会有白色的新疆虫草菌菌丝发出。若菌段被杂菌污染，则会显现出杂菌的菌丝形态和颜色；若培养基的空白处有污染，也会显现杂菌菌落。据此，将感染杂菌的培养皿剔除；将未染杂菌的菌段在无菌条件下，转接至500ml塑料组培瓶中。

步骤4.将组培瓶在16-20℃、避光、40-70%rh条件下培养15-70天，让转接的新疆虫草菌在组培瓶的固体培养基上充分生长，直至菌丝长满培养基表面。

步骤5.将组培瓶转移至8-15℃、16l（光照强度200-500lx）:8d、60-90%rh条件下进行冷诱导，诱导培养14-90天，即可使新疆虫草长出子实体原基。然后，将组培瓶中的子实体原基在无菌条件下，转接至100ml玻璃锥形瓶中。

步骤6.将玻璃锥形瓶中转移至9-16℃、16l（光照强度800-2000lx）:8d、60-90%rh条件下培养30-90天，培养新疆虫草子实体，并使其成熟。

步骤7.在子实体的生长和成熟过程中，颈部逐渐伸长，顶端颜色逐渐加深，由最初的嫩黄色，变为土黄色，直至浅黄褐色，并在表面显现为橘皮样结构，在橘皮样结构表面可见与周围颜色不一致的散点状均匀分布的子囊壳口孔。

步骤8.此时，将子实体顶端结构取出一部分，转接至新的固体培养基上，在16℃、16l（光照强度1200lx）:8d、自然相对湿度条件下培养10天后，发现子实体周边会显现出很多小的菌落，实为成熟的子实体上子囊壳经由子囊壳口孔释放的子囊孢子所形成。随着培养的继续，菌落在子实体附近逐渐生长连接为一体，周边依然可见由释放的子囊孢子形成的散点状菌落。

再次取出前述人工培育的部分子实体，随后取出由人工培育的子实体释放的孢子所形成的散点状菌落，分别进行分子鉴定。方法如下：分别利用基因组提取试剂盒（康为，cw0552），按照说明书提取其基因组后，利用its通用引物（上游引物序列如seqidno:1所示，下游引物序列如seqidno:2所示）进行pcr，然后，分别将前述pcr产物进行切胶回收，连接t载（pmd-19t，takara）后送出测序（上海生工），结果显示所测得的整体its序列均如seqidno:3所示。

进一步，步骤3中，将培养皿在18℃、避光、40-70%rh条件下培养6天。

进一步，步骤4中，将组培瓶在180℃、避光、40-70%rh条件下培养15天。

进一步，步骤5中，将组培瓶转移至12℃、16l、光照强度300lx:8d、60-90%rh条件下进行冷诱导，诱导培养14天。

进一步，步骤6中，将玻璃锥形瓶中转移至14℃、16l、光照强度1200lx:8d、60-90%rh条件下培养30天。

进一步，步骤8中，pcr程序为:94℃预变性2min，94℃变性45s，52-48℃退火45s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸循环8次，每循环一次，退火温度降低0.5℃；94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸1min，变性、退火、延伸循环28次，每循环一次，退火温度保持48℃；72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明培育出了新疆虫草菌的子实体，并且该子实体能弹射子囊孢子，并子囊孢子可萌发形成新菌落，人工培育新疆丛草子实体的方法，对于加快新疆虫草的人工培育，以及满足消费者对于虫草的降价需求等方面有重要的价值。

附图说明

图1是虫草菌的分离培养示意图，左图为刚接种的新疆虫草，右图为6天后在新疆虫草表面可见有菌丝发出；

图2是人工培养生成的新疆虫草菌子实体原基；

图3是虫草菌的子实体的生长过程示意图，图3a为子实体初长成的状态图；图3b为子实体继续生长的状态图；图3c为子实体长成后的状态图；

图4是人工培养的子实体在转瓶后的可育性图，箭头所示为子囊壳开口。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施方案对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种新疆虫草菌子实体的人工培育方法，包括以下步骤：

步骤1.固体培养基的制备：固体培养基的配方为：葡萄糖20g/l、新鲜马铃薯200g/l(去皮、切碎、煮沸30min、纱布过滤取上清)、蛋白胨10g/l、酵母粉10g/l、mgso4·7h2o0.07g/l、kh2po40.7g/l、琼脂18g/l。先将固体培养基，蒸汽灭菌后（121℃、20min），在超净工作台内倒入90mm无菌培养皿中（每皿18ml），冷却备用。同时，将上述培养基，配制于500ml塑料组培瓶中（每瓶150ml）以及100ml玻璃锥形瓶中（每瓶30ml），然后经蒸汽灭菌（121℃、20min），冷却后备用。

步骤2.在超净工作台中，将野外采集到的新鲜新疆虫草，清除表面泥土和杂物，用含75％乙醇的酒精棉擦洗虫草表面，然后在0.1％氯化汞溶液中消毒4min，无菌水冲洗后，再用灭菌后的滤纸吸干水分，之后，用灭过菌的单面刀片，切去虫草表皮，避开其寄主的消化道，再切取约0.2-0.6cm长的新疆虫草菌段，接种于培养皿中的固体培养基上（图1）。

步骤3.将培养皿在16-20℃、避光、40-70%rh条件下培养6-15天。此时，在接种的菌段上会有白色的新疆虫草菌菌丝发出（图1）。若菌段被杂菌污染，则会显现出杂菌的菌丝形态和颜色；若培养基的空白处有污染，也会显现杂菌菌落。据此，将感染杂菌的培养皿剔除；将未染杂菌的菌段在无菌条件下，转接至500ml塑料组培瓶中。

步骤4.将组培瓶在16-20℃、避光、40-70%rh条件下培养15-70天，让转接的新疆虫草菌在组培瓶的固体培养基上充分生长，直至菌丝长满培养基表面。

步骤5.然后，将组培瓶转移至8-15℃、16l（光照强度200-500lx）:8d、60-90%rh条件下进行冷诱导，诱导培养14-90天，即可使新疆虫草长出子实体原基（图2）。然后，将组培瓶中的子实体原基在无菌条件下，转接至100ml玻璃锥形瓶中。

步骤6.将玻璃锥形瓶中转移至9-16℃、16l（光照强度800-2000lx）:8d、60-90%rh条件下培养30-90天，培养新疆虫草子实体，并使其成熟（图3a-图3c）,其中图3a，子实体初长成；图3b，子实体继续生长；图3c，子实体长成后（同时，比图3b顺时针旋转90度），待转瓶验证子囊孢子可育性。

步骤7.在子实体的生长和成熟过程中，颈部逐渐伸长，顶端颜色逐渐加深，由最初的嫩黄色，变为土黄色，直至浅黄褐色，并在表面显现为橘皮样结构，在橘皮样结构表面可见与周围颜色不一致的散点状均匀分布的子囊壳口孔。

步骤8.此时，将子实体顶端结构取出一部分，转接至新的固体培养基上，在16℃、16l（光照强度1200lx）:8d、自然相对湿度条件下培养10天后，发现子实体周边会显现出很多小的菌落，实为成熟的子实体上子囊壳经由子囊壳口孔（图4，箭头所示）释放的子囊孢子所形成。随着培养的继续，菌落在子实体附近逐渐生长连接为一体，周边依然可见由释放的子囊孢子形成的散点状菌落（图4）。

再次取出前述人工培育的部分子实体，随后取出由人工培育的子实体释放的孢子所形成的散点状菌落，分别进行分子鉴定。方法如下：分别利用基因组提取试剂盒（康为，cw0552），按照说明书提取其基因组后，利用its通用引物（上游引物序列为：tcctccgcttattgatatgc，下游引物序列为：ggaagtaaaagtcgtaacaagg）进行pcr，程序为:94℃预变性2min，94℃变性45s，52-48℃退火45s，72℃延伸1min，循环8次（变性、退火、延伸，每循环一次，退火温度降低0.5℃）；94℃变性45s，48℃退火45s，72℃延伸1min，循环28次（变性、退火、延伸，每循环一次，退火温度保持48℃）；72℃延伸5min）。然后，分别将前述pcr产物进行切胶回收，连接t载（pmd-19t，takara）后送出测序（上海生工），结果显示所测得的整体its序列均如seqidno:3所示。

将测序所得序列与ncbi数据库的核酸序列进行比对后发现，该序列与ophiocordycepsgracilis（accesion:hm142942.1）的its序列的相似性为100%。以上结果证明我们人工培育所得到的子实体为新疆虫草的子实体且该子实体可育。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。