一种红葱的组培快繁方法与流程

本发明属于植物组织培养
技术领域：
，具体涉及一种红葱的组培快繁方法。
背景技术：
：“红葱”为百合科葱属(allium)葱的一个变种，其独特浓郁的葱味尤其受喜食羊肉的西北地区百姓喜爱。其假茎膨大不明显，老熟后成褐红色的葱衣包裹假茎，故名“红葱”。花茎圆柱形，中空，其特点是花茎上不生种子，而在花茎的顶部由花器发生气生小葱。常规繁殖方法以分蘖和花茎上的气生小葱繁殖，繁殖系数低，无法满足人们生产生活需要。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种红葱的组培快繁方法，该方法以茎尖分生组织为外植体，通过初代培养、丛生芽诱导增殖和生根炼苗的过程，建立其组培快繁体系，此发明繁殖系数高，可解决“红葱”常规依靠分蘖和气生小葱繁殖中扩繁系数低的问题，而且不受季节限制，实际应用性强。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种红葱的组培快繁方法，该方法为：s1、外植体的取材与消毒：4月下旬挖取红葱的完整植株，切去全部根毛和植株形态学上端全部葱叶，剥去假茎外部几层叶片，用清水冲洗30min以上，得到外植体初始材料；s2、茎尖剥离与初代培养：在超净工作台中将s1中得到的外植体初始材料用体积分数为75％的乙醇溶液消毒，再用质量分数为0.1％的升汞溶液进行消毒，用无菌水冲洗后，置于实体解剖镜下剥去外层叶片，当看到一个闪亮半球形组织时，自半球形组织的下端0.5mm处切取带有2～3个叶原基的茎尖分生组织置于初代培养基中封口后培养20d～25d，得到转绿变大的芽点；所述初代培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中初代培养基中6-ba的质量浓度为0.2mg/l，naa的质量浓度为0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；s3、丛生芽诱导和增殖培养:在超净工作台中将s1中得到的转绿变大的芽点置于丛生芽诱导培养基中培养至丛生芽长至约2cm～3cm时，以2个～3个丛生芽为一丛进行分割，转接到增殖培养基中封口后培养20d～25d，得到幼苗；所述丛生芽诱导培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中丛生芽诱导培养基的6-ba的质量浓度为1mg/l、naa的质量浓度为0.2mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；所述增殖培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中增殖培养基的6-ba的质量浓度为0.5mg/l、naa的质量浓度为0.1mg/l、卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；s4、壮苗与生根：在超净工作台中将s3中得到的幼苗转入生根培养基中封口后生根和壮苗培养20d～25d，得到生根苗；所述生根培养基由naa、卡拉胶和蔗糖加入至1/2ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中生根培养基的质量浓度为naa0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为15g/l；s5、驯化移栽：去掉封口膜，将s4中得到的丛生苗在散射光下放置2d后，用清水冲洗后，移栽于育苗钵中，培养得到红葱；s2和s3中每升所述ms培养基中含有以下原料：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、cacl2·2h2o440mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2·moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2·edta·2h2o37.3mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l；s4中每升所述1/2ms培养基中含有以下原料：nh4no3825mg/l、kno3950mg/l、cacl2·2h2o220mg/l、mgso4·7h2o185mg/l、kh2po485mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2·moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2·edta·2h2o37.3mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l。优选地，s2中所述乙醇溶液的消毒时间为1min；所述升汞溶液的消毒时间为6min。优选地，s3中所述幼苗的长度为4cm～6cm。优选地，s4中所述生根苗的平均生根数≥7条；所述生根苗的根长为3cm～4cm。优选地，s5中所述育苗钵的基质为质量比为3∶1的草炭和蛭石的混合物。优选地，s2、s3和s4中培养的条件均为：温度为23℃～25℃；光照强度为1500lx～2000lx；每天光照时间为12h，湿度为60％～70％。本发明与现有技术相比具有以下优点：本发明以茎尖分生组织为外植体，本发明是利用茎尖分生组织为外植体，不经脱分化为愈伤组织—分化为幼苗的阶段，建立快繁体系的过程，避免了经愈伤组织阶段进行再分化易产生变异的风险。通过初代培养、丛生芽诱导增殖和生根炼苗的过程，建立其组培快繁体系，本发明的红葱的繁殖系数高，可解决“红葱”常规依靠分蘖和气生小葱繁殖中扩繁系数低的问题，而且不受季节限制，实际应用性强。下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。附图说明图1是本发明的实施例1的s2中初代培养基中培养的转绿变大的芽点图(左为单个培养基图，箭头所指为转绿变大的芽点，右为整体图)。图2是本发明的实施例1的s3中丛生芽诱导培养基中诱导的丛生芽图。图3是本发明的实施例1的s3中增殖培养基中培养的幼苗图。图4是本发明的实施例1的s4中生根培养基中培养的生根苗图。图5本发明的实施例1的s5中移栽培养的红葱图。图6本发明的实施例1的s5中移栽后的培养的红葱越冬后的生长图。具体实施方式实施例1本实施例的红葱的组培快繁方法，该方法为：s1、外植体的取材与消毒：4月下旬挖取红葱的完整植株，切去全部根毛和植株形态学上端全部葱叶，剥去假茎(葱白部分)外部几层叶片，用清水冲洗30min以上，得到外植体初始材料；s2、茎尖剥离与初代培养：在超净工作台中将s1中得到的外植体初始材料用体积分数为75％的乙醇溶液消毒1min，再用质量分数为0.1％的升汞溶液进行消毒6min，用无菌水冲洗后，置于实体解剖镜下剥去外层叶片，当看到一个闪亮半球形组织时，自半球形组织的下端0.5mm处切取带有2～3个叶原基的茎尖分生组织置于初代培养基中封口后，在温度为23℃～25℃；光照强度为1500lx～2000lx；每天光照时间为12h，湿度为60％～70％的条件培养20d～25d，得到转绿变大的芽点(图1)；所述初代培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中初代培养基中6-ba的质量浓度为0.2mg/l，naa的质量浓度为0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；s3、丛生芽诱导和增殖培养:在超净工作台中将s1中得到的转绿变大的芽点置于丛生芽诱导培养基中培养至丛生芽(图2)长至约2cm～3cm时，以2个～3个丛生芽为一丛进行分割，转接到增殖培养基中封口后，在温度为23℃～25℃；光照强度为1500lx～2000lx；每天光照时间为12h，湿度为60％～70％的条件培养20d～25d，得到长度为4cm～6cm的幼苗(图3)；所述丛生芽诱导培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中丛生芽诱导培养基的6-ba的质量浓度为1mg/l、naa的质量浓度为0.2mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；所述增殖培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中增殖培养基的6-ba的质量浓度为0.5mg/l、naa的质量浓度为0.1mg/l、卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；s4、壮苗与生根：在超净工作台中将s3中得到的幼苗转入生根培养基中封口后，在温度为23℃～25℃；光照强度为1500lx～2000lx；每天光照时间为12h，湿度为60％～70％的条件下生根和壮苗培养20d～25d，得到平均生根数≥7条、根长为3cm～4cm的生根苗(图4)；所述生根培养基由naa、卡拉胶和蔗糖加入至1/2ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中生根培养基的质量浓度为naa0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为15g/l；s5、驯化移栽：去掉封口膜，将s4中得到的丛生苗在散射光下放置2d后，用清水冲洗后，移栽于基质为质量比为3∶1的草炭和蛭石的混合物的育苗钵中，培养得到红葱(图5)；s2和s3中每升所述ms培养基中含有以下原料：nh4no31650mg/l、kno31900mg/l、cacl2·2h2o440mg/l、mgso4·7h2o370mg/l、kh2po4170mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2·moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2·edta·2h2o37.3mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l；s4中每升所述1/2ms培养基中含有以下原料：nh4no3825mg/l、kno3950mg/l、cacl2·2h2o220mg/l、mgso4·7h2o185mg/l、kh2po485mg/l、ki0.83mg/l、h3bo36.2mg/l、mnso4·4h2o22.3mg/l、znso4·7h2o8.6mg/l、na2·moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、na2·edta·2h2o37.3mg/l、肌醇100mg/l、烟酸0.5mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l和甘氨酸2mg/l。经过本实施例的红葱的组培快繁方法繁殖的西北红葱，移栽成活率在90％以上，11月份日平均气温0℃时浇封冻水，第二年春三月份浇解冻水，可顺利越冬，越冬成活率高(图6)。试验条件的优化：(1)初代培养基配方筛选：s2中的初代培养基采用m1-m5，各培养基的配方由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中卡拉胶的质量浓度均为5g/l，蔗糖的质量浓度均为30g/l，6-ba和naa的浓度不同(见表1中)，每处理接种30个茎尖，3次重复。统计茎尖正常生长率和出愈率。茎尖正常生长率＝(茎尖正常伸长的数目/接种茎尖数)×100％出愈率＝(产生愈伤组织的茎尖数/接种茎尖数)×100％表1茎尖初代培养试验设计与结果培养基6-ba(mg/l)naa(mg/l)正常生长率(％)出愈率(％)m10.10.0267.78c8.89m20.10.155.56e15.56m30.20.191.11a6.67m40.50.172.22b12.22m50.50.263.35d13.37注：表中标注字母为duncan新复极差分析结果,小写字母表示0.05水平显著。下同。初代培养的目的是启动茎尖生长，避免愈伤组织的产生。约20天，茎尖分生组织有较明显变化：m3培养基上茎尖明显伸长，浓绿，正常生长率91.11％，显著高于其他4个处理。其愈伤组织形成率为6.67％，显著低于其他处理。符合初代培养启动茎尖生长、避免愈伤组织产生的目的。m2培养基上愈伤组织形成率较高，可能是“红葱”茎尖分生组织本身生长素浓度较高，naa与6-ba浓度之比较大时可诱导愈伤组织的形成。因此，初代培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中初代培养基中6-ba的质量浓度为0.2mg/l，naa的质量浓度为0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；因此初代培养基选择m3，即初代培养基由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中初代培养基中6-ba的质量浓度为0.2mg/l，naa的质量浓度为0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；(2)丛生芽诱导和增殖培养：①丛生芽诱导培养基的选择：为研究6-ba和naa对“红葱”丛生芽诱导的影响，以ms为基本培养基，6-ba和naa为2试验因素，各3个水平，即6-ba设计0.5mg/l、1.0mg/l和2.0mg/l三个水平，naa设计0.1mg/l、0.2mg/l和0.3mg/l三个水平，进行交叉分组试验，三次重复，每重复30个，将经过初代培养后得到的转绿变大的芽点用不同的丛生芽诱导培养基(c1-c9)，各培养基的配方由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中卡拉胶的质量浓度均为5g/l，蔗糖的质量浓度均为30g/l，6-ba和naa的浓度不同(见表2中)。表2丛生芽诱导培养基试验设计和培养结果分别用各丛生芽诱导培养基(c1-c9)培养约14d可以看到依据培养基不同，茎尖上产生2～5个不等的不定芽，丛生芽形成。从表2可见，丛生芽诱导率和平均出芽数在不同激素配比间差别较大，丛生芽诱导率在34.4～93.3％之间，平均出芽数在1.22～4.74之间，丛生芽诱导率和平均出芽数变化趋势基本一致。其中，在c4培养基上，丛生芽形成率93.3％，平均出芽数4.74个，显著高于c1培养基上的诱导效果，约20d丛生芽长至约2cm。可能在“红葱”丛生芽诱导过程中，细胞分裂素和生长素既需要达到一定浓度水平，而且二者需要达到一个恰当的激素配比，才能诱导丛生芽的形成。因此，所述丛生芽诱导培养基选择c4，即由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中丛生芽诱导培养基的6-ba的质量浓度为1mg/l、naa的质量浓度为0.2mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；②增殖培养基的选择：表3增殖培养基试验设计和培养结果将经过丛生芽诱导培养基c4培养得到的丛生芽以2～3个一丛进行分割，接种在丛生芽诱导培养基进行丛生芽增殖试验，20d后统计丛生芽诱导率和增殖系数。由表3可见，增殖培养基采用与丛生芽诱导培养基相同的配方设计，培养结果不同：c1上丛生芽诱导率为100％，显著高于其他处理，丛生芽诱导率从大到小依次为c2、c5、c3、c4、c6、c7、c9和c8，增殖系数表现与丛生芽诱导率大致相同，处理间差异显著，c1显著高于其他处理，依据显著性水平高低依次为c1、c2、c5、c3、c4、c7、c6、c9和c8。表明，继续用培养基c4进行增殖培养，增殖效果显著低于c1，考虑外源激素可能在“红葱”中会有累积效应。因此，增殖培养基选择c1，即由6-ba、naa、卡拉胶和蔗糖加入至ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中增殖培养基的6-ba的质量浓度为0.5mg/l、naa的质量浓度为0.1mg/l、卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为30g/l；丛生芽诱导率＝(丛生芽形成数/接种茎尖数或接种丛数)×100％；2株接种：增殖系数＝增殖苗总数/接种丛数/2；3株接种：增殖系数＝增殖苗总数/接种丛数/3。(4)壮苗与生根在植物组织培养的生根环节，广泛使用生长素中的iba和naa，所以试验设计这两种生长素对组培苗生根的效果。待丛生苗长至约5cm时转入生根培养基中进行壮苗与生根培养，生根培养基(d1-d4)由naa或iba、卡拉胶和蔗糖加入至1/2ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中卡拉胶的质量浓度均为5g/l，蔗糖的质量浓度均为15g/l，不同之处为naa或iba的浓度不同，并以未添加naa或iba的培养基作为对照(ck),如表3-4所示,每处理30个幼苗，重复3次。培养20天后统计生根率、根数和根长。生根率＝(生根的植株数/接种的植株数)×100％平均生根数＝生根植株总生根条数/生根植株总数平均根长＝生根总长度/生根植株总生根条数表4生根培养基设计及生根情况注：“-”表示无添加。此步骤可将壮苗与生根同时完成。约10天开始有乳白色根状突起，组培苗更为健壮，葱叶浓绿。约20d后，生根情况表明：生根率、平均生根数和平均根长在不同激素间表现出较大差异：附加naa上的生根率显著高于iba上的生根率，平均生根数这一指标d6显著高于d2、d3和其他处理，平均根长这一指标表现为d6显著高于d5、d2和其他处理。后期移栽成活率取决于生根率、生根数、根长和根的生长状况的综合情况，所以生根培养基选择d2，生根率为100％，每株幼苗平均生根数7条以上，根系粗壮，说明“红葱”组培苗在生根过程中需要一定浓度的生长素，以naa为宜。由上表筛选出生根培养基由naa、卡拉胶和蔗糖加入至1/2ms培养基并调节ph至5.8而制成，其中生根培养基的质量浓度为naa0.1mg/l，卡拉胶的质量浓度为5g/l，蔗糖的质量浓度为15g/l；将经过生根培养基d1壮苗和生根培养后，根长达到3cm时，按着实施例1中的s5步骤中的方法进行移栽，移栽后，前10d在温室内搭建小拱棚维持较高湿度，同时注意与外界的气体交换顺利，然后拿掉小拱棚，温室内遮荫15d左右，即可大田或保护地定植，移栽成活率在90％以上。以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制。凡是根据发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变化，均仍属于本发明技术方案的保护范围内。当前第1页12