一种中国小麦花叶病毒CWMV的接种方法与流程

本发明属于植物病毒接种技术领域，尤其涉及一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法。

背景技术：

中国小麦花叶病毒(chinesewheatmosaicvirus，cwmv)是上世纪九十年代在我国山东冬小麦上鉴定的一种由禾谷多黏菌传播的土传病毒(chenj.annalsofappliedbiology,1993,123(1):55-61)近年来cwmv侵染的病区不断扩大，导致小麦减产10％～30％，甚至是70％。2018年冬季由于雨水充足，低温持续时间长，中国小麦花叶病毒病发病尤为严重。到目前为止尚未研究出有效且有针对性的防治土传病毒病害的防治措施，生产上唯一有效的防治办法是选育抗病品种，但抗性种质资源较匮乏，导致抗病品种的选育十分困难，以至于防控该病毒病害仍是世界性难题(陈剑平.浙江农业学报,2005,04:1004-1524)cwmv属于帚状病毒科的真菌传杆状病毒属(furovirus)，其最适侵染温度为15-17℃，感染后的小麦表现出花叶、矮化、分蘖减少等症状。对cwmv的病毒粒子结构和基因组结构进行解析发现其为是单链正义rna(ssrna)病毒，包含rna1和rna2两条基因组。目前，对cwmv的研究主要集中于病毒的分布、生物学特性、病害流行规律等方面，但对于cwmv的致病机制鲜少报道。植物病毒的成功感染源于复杂的分子结构寄主植物和入侵病毒之间的相互作用。为了研究寄主是如何识别和抵抗cwmv侵染，在实验室条件下成功接种cwmv就显得尤为重要。目前小麦接种cwmv病毒采用的是摩擦接毒的方法，由于摩擦接毒效率低，步骤繁琐，且成本高导致小麦和cwmv互作的研究进展缓慢。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法，所述接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒cwmv在小麦上的接种率，接毒步骤简单，能够实现快速批量接种。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法，包括以下步骤：将茎叶总长度为4～8cm的小麦幼苗置于cwmv浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理25～35min，然后将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养；

所述cwmv浸润液包括cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子。

优选的，每一株小麦幼苗置于400～600μl的cwmv浸润液中。

优选的，所述cwmv浸润液以mes缓冲液为溶剂，其中cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子的od600比例为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)。

优选的，所述cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子在所述cwmv浸润液中的od600值分别为0.6～0.8，0.6～0.8和0.6～0.8。优选的，所述抽真空处理的时间为28～32min；所述抽真空处理过程中，每隔8～12min停止一次，去除cwmv浸润液中的气泡。

优选的，小麦幼苗移栽至土壤中培养的时间为7～28d。

优选的，所述培养的温度为7～9℃，所述培养的光照周期l:d为14:10；所述培养的湿度为73％～78％。

优选的，所述小麦幼苗的培育方法包括以下步骤：将小麦种子在自来水中24～26℃浸泡10～14h后获得芽头露白的种子；将所述芽头露白的种子保湿培养3～4d获得小麦幼苗。

本发明的有益效果：本发明提供的中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法，利用cwmv侵染性克隆，模拟小麦田间由根部侵入，通过抽真空处理将中国小麦花叶病毒cwmv从根部吸入小麦，并使得中国小麦花叶病毒cwmv在整株小麦上系统侵染；所述接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒cwmv在小麦上的接种率，简化了接毒步骤，并实现了快速批量接种。本发明所述的接种方法不涉及任何试剂盒及昂贵试剂，大大节约了接种中国小麦花叶病毒cwmv的成本；所述接种方法也不涉及如体外转录、人工摩擦等复杂的实验步骤，操作简单；能够实现在小麦上快速批量接种中国小麦花叶病毒cwmv。

附图说明

图1为本发明提供的接种方法的操作流程示意图；

图2为小麦幼苗移栽至土壤中培养7天、14天、28天时，根茎叶cwmv-cp检测结果；

图3为批量接种14天后小麦叶片cwmv-cp检测结果；其中m为marker，+为阳性对照，-为阴性对照，1～34为34个接种样品；

图4为对比例1中的方法接种后14天时，叶片cwmv-cp检测结果，其中m为marker，+为阳性对照，-为阴性对照，2～13分别为接种样品。

具体实施方式

本发明提供了一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法，包括以下步骤：将茎叶总长度为4～8cm的小麦幼苗置于cwmv浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理25～35min，然后将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养；所述cwmv浸润液包括cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子。

在本发明中，所述小麦幼苗的培育方法优选的包括以下步骤：将小麦种子在自来水中24～26℃浸泡10～14h后获得芽头露白的种子；将所述芽头露白的种子保湿培养3～4d获得小麦幼苗。在本发明中，所述种子的浸泡温度优选为25℃，所述浸泡的时间优选为12h。在本发明中，所述芽头露白的种子保湿培养优选的在吸水纸上进行。

在本发明中，所述cwmv浸润液中cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子优选的以转化农杆菌培养液的形式存在。在本发明中，所述cwmvrna1、cwmvrna2和p19的核苷酸序列分别如seqidno.1～3所示。在本发明中，所述转化农杆菌培养液的制备方法包括以下步骤：通过电击转化的方法将cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子分别转化入gv3101的农杆菌中，并用含有50μg/ml卡娜青霉素+50μg/ml庆大霉素+50μg/ml利福平三种抗生素的yep培养基分别在28℃摇培14～16h获得cwmvrna1-转化农杆菌培养液、cwmvrna2转化农杆菌培养液和p19沉默抑制子-转化农杆菌培养液。在本发明中，分别将所述cwmvrna1-转化农杆菌培养液、cwmvrna2转化农杆菌培养液和p19沉默抑制子-转化农杆菌培养液离心后收集cwmvrna1-转化农杆菌菌体、cwmvrna2转化农杆菌菌体和p19沉默抑制子-转化农杆菌菌体；本发明对所述离心的转速和时间没有特殊限定，采用本领域常规的离心菌体的转速和时间即可。

在本发明中，所述cwmv浸润液优选以mes缓冲液为溶剂，稀释上述离心获得的菌体，其中cwmvrna1-转化农杆菌菌体、cwmvrna2转化农杆菌菌体和p19沉默抑制子-转化农杆菌菌体的浓度比例优选为(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)，更优选为1:1:1。在本发明中，所述cwmvrna1-转化农杆菌菌体、cwmvrna2转化农杆菌菌体和p19沉默抑制子-转化农杆菌菌体在所述cwmv浸润液中的od600值分别优选为0.6～0.8，0.6～0.8和0.6～0.8，更优选为0.7，0.7和0.7。

在本发明中，将小麦幼苗置于cwmv浸润液中，在标准大气压下进行抽真空处理。在本发明中，每一株小麦幼苗优选的置于400～600μl的cwmv浸润液中，更优选的为450～550μl，最优选的为500μl。在本发明具体实施过程中，优选的将所述小麦幼苗和cwmv浸润液置于无菌离心管中；所述无菌离心管的规格优选为2ml；所述小麦幼苗根部朝下，根部浸没于cwmv浸润液中，所述离心管敞口放置。在本发明中，所述抽真空处理优选的在真空干燥器中进行，所述抽真空处理的时间优选为28～32min，更优选为30min；所述抽真空处理过程中，每隔8～12min停止一次，优选的每隔10min停止一次；停止抽真空处理后，通过轻弹离心管的方式去除cwmv浸润液中的气泡，然后继续进行抽真空处理。

本发明在所述抽真空处理后，将小麦幼苗移栽至土壤中进行培养。在本发明中，所述小麦幼苗移栽至土壤中培养的时间优选为7～28d；所述培养的温度优选为7～9℃，更优选为8℃；所述培养的光照周期l:d优选为14:10；所述培养的湿度优选为73％～78％，更优选为75％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1)小麦种子在自来水中25℃浸泡12h过夜；

2)将芽头露白的种子摆放在吸水纸上保湿培养3天，获得茎叶总长度为4～8cm小麦幼苗；

3)通过电击转化的方法将cwmvrna1、cwmvrna2和p19沉默抑制子分别转化入gv3101的农杆菌中，并用含有50μg/ml卡娜青霉素+50μg/ml庆大霉素+50μg/ml利福平三种抗生素的yep培养基分别在28℃摇培15h，获得cwmvrna1-转化农杆菌培养液、cwmvrna2转化农杆菌培养液和p19沉默抑制子-转化农杆菌培养液。

4)用mes缓冲液(10mmmes；10mmmgcl2；0.2mmas)稀释离心后收集的菌体，制备成cwmvrna1:cwmvrna2:p19od600＝1:1:1的cwmv浸润液；cwmv浸润液中cwmvrna1-转化农杆菌菌体、cwmvrna2转化农杆菌菌体和p19沉默抑制子转化农杆菌菌体的od600均为0.7。

5)将培养好的小麦幼苗摆入2mlep管，每管加入500μlcwmv浸润液；

6)将摆有小麦的2mlep管放入真空干燥器中真空抽30min，期间每隔10min停一次，取出轻弹去气泡后继续；

7)将小麦幼苗取出种入土中，在8℃，每日光照14h，黑暗10h，湿度75％条件下培养，每隔七天取样检测一次。

用rna试剂盒(r4151-03,magen)分别提取小麦种植7天、14天和28天后的根茎叶rna；

总rna反转录成cdna。反应体系为：1μlrandom(10μm)，1μg总rna，用depc水补齐至12μl。反应条件：42℃，5min，反应结束后，向其中加入4μl5×rtbuffer，2μldntpmix，1μlrnaseinhibitor，1μlrevertraace，用移液器轻轻吹打混匀，经30℃，10min；42℃，20min；99℃，5min；4℃，5min反应程序合成cdna。反转录后以cdna为模板，cwcpf:atggccgtgaaatctggttat(seqidno.4)；cwcpr:acactcgaaccttcccacttaag(seqidno.5)为验证引物pcr反应程序为第一步95℃，5min；第二步95℃，30sec；56℃，30sec；72℃，30sec；运行30个循环；第三步72℃，10min，4℃，5min鉴定确定小麦植株是否成功接种cwmv。

结果如图2和图3所示，小麦植株成功接种中国小麦花叶病毒cwmv，抽真空后种植7天、14天和28天后的根茎叶均能侵染cwmv，且cwmv稳定存在于小麦植株的根茎叶中。

对比例1

1)小麦种子在自来水中26℃浸泡10h过夜；

2)将芽头露白的种子摆放在吸水纸上保湿培养4天，获得茎叶总长度为4～8cm小麦幼苗；

3)将培养好的小麦幼苗栽培与营养土中，长到两叶一芯期；

4)将含有cwmv和cwmvr2的dh5α克隆菌5ml，接种于含50卡娜青霉素的新鲜lb液体培养基中。37℃，200r/min振荡培养24h。8000r/min离心10min收获菌体。用magenplasmidmidikit提取质粒，利用pharmaciabiotech公司的ultrospec3000测定质粒浓度，要求质粒浓度大于1μg/μl。对质粒进行线性化备用。

5)利用ambionmessagemachinekit(invitrogen)t7-capped体外转录试剂盒体外转录获得cwmvr1和cwmvr2rna。

6)将体外转录获得的rna加入200μlfes中在无rna酶的环境下摩擦接种在小麦二叶期的第二叶上。

7)将摩擦接种的小麦在30℃，湿度90％条件下黑暗培养24h后，按每日光照14h，黑暗10h条件培养，每隔七天取样检测一次。

分别提取小麦种植7天、14天和28天后的根茎叶rna；

rna反转录后通过pcr鉴定确定小麦植株是否成功接种cwmv。

(yangetal,thejournalofgeneralvirology,2016,97,2441-2450.)

结果见图4小麦植株部分成功接种中国小麦花叶病毒cwmv，接种7天、14天和28天后cwmv侵染率低。且体外转录试剂盒价格昂贵。

由上述实施例可知，本发明提供的接种方法能够显著提高中国小麦花叶病毒cwmv在小麦上的接种率，简化了接毒步骤，并实现了快速批量接种。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>宁波大学

<120>一种中国小麦花叶病毒cwmv的接种方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>7147

<212>dna

<213>chinesewheatmosaicvirus

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