铁死亡诱导剂Erastin构建体内铁死亡小鼠模型的方法及应用与流程

本发明属于生物医学技术领域，特别是涉及铁死亡诱导剂erastin构建体内铁死亡小鼠模型的方法及应用。

背景技术：

细胞死亡在动物机体中无时无刻不在发生，是生命活动中不可或缺的。细胞死亡分为两大类：意外性细胞死亡和调节性细胞死亡。意外性细胞死亡指的是由严重的物理或化学损伤引起的，不能通过分子干扰逆转的细胞死亡方式。而调节性细胞死亡则由特定的信号通路参与，一组确定的效应分子执行，具有独特的生化、免疫学后果和功能，调节着机体的生命活动。铁死亡于2012年被发现并命名，是一种铁依赖的、由脂质过氧化物积累过多而导致的新型调节性细胞死亡。这种细胞死亡方式，主要有三大特征：氧化应激水平升高、铁沉积、抗氧化能力减弱。所以铁死亡发生时，常常表现为铁沉积，ptgs2基因表达水平、mda含量升高（氧化应激指标），gsh含量、gpx4蛋白水平降低（抗氧化指标）。

铁死亡已被证明与体内许多器官疾病有关，比如结肠炎、心肌病、脂肪肝等，但在非病理条件下，即正常生理条件下，铁死亡对机体的影响未见报道。而作为一种细胞死亡方式，铁死亡在细胞层面的研究较为多见，但是在体内组织器官层面的研究较少。如果有方法可以建立起正常生理条件下体内铁死亡的动物模型，那么将为后续的铁死亡在体内的研究奠定基础，有助于进一步研究铁死亡在正常生理条件下在体内作用的机制，对后续的铁死亡生理生化研究具有重要意义。

目前仍没有方法可以系统建立体内铁死亡的动物模型，所以当前生物医药领域亟需一种可以稳定、高效、全面、便捷建立体内铁死亡动物模型的方法。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供铁死亡诱导剂erastin构建体内铁死亡小鼠模型的方法及应用。

本发明提供的铁死亡诱导剂erastin构建体内铁死亡小鼠模型的方法，包括：

步骤一，以质量百分比含量5%二甲亚砜+40%聚乙二醇400+5%吐温-80+50%生理

盐水的配方配制溶剂；

步骤二，将铁死亡诱导剂erastin用自制溶剂配制成100mg/ml的悬浮液；

步骤三，给标准条件下饲养的8周龄小鼠腹腔注射100mg/kg体重的erastin悬浮液，每12h腹腔注射一次，共4次，所述的标准条件指，温度24～28℃，相对湿度50%～70%，每天光照12h、黑暗12h；

这种动物模型体内发生铁死亡，表现为血清铁、总铁结合力升高，主要器官中前列腺素内过氧化物合酶2（ptgs2）基因表达水平、丙二醛（mda）含量升高，谷胱甘肽（gsh）含量、人胱氨酸/谷氨酸转运蛋白轻链（slc7a11）、谷胱甘肽过氧化物酶4（gpx4）蛋白表达降低。

本发明还提供上述体内铁死亡小鼠模型的应用，这种体内铁死亡的小鼠模型可用于作为研究轻微脑梗死、肾小球增大、肠道绒毛增粗变高、脾脏棕色物质沉积，以及脑、肾、肠、脾铁沉积增强的动物模型。

本发明的有益效果：

1.本发明可用于在正常生理条件下，诱导小鼠体内发生铁死亡；

2.本发明可用于研究体内铁死亡对小鼠各组织器官的影响及表观变化，以及研究体内发生铁死亡的机制；

3.本发明可用于作为研究轻微脑梗死、肾小球增大、肠道绒毛增粗变高、脾脏棕色物质沉积，以及脑、肾、肠、脾铁沉积增强的动物模型。

本发明在后续铁死亡的体内研究中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是成功构建体内铁死亡小鼠模型的结果图，以上结果为6次独立重复实验平均值。其中a部分：erastin注射对血清铁含量的影响。b部分：erastin注射对血清总铁结合力的影响。c部分：erastin注射对肠、肾、肝、脾ptgs2mrna表达水平的影响。d部分：erastin注射对肠、肾、肝丙二醛含量的影响。e部分：erastin注射对肠、肾、肝gsh含量的影响。f部分：erastin注射对肠道中slc7a11和gpx4蛋白表达水平的影响及wb定量分析。g部分：erastin注射对肾脏中slc7a11和gpx4蛋白表达水平的影响及wb定量分析。h部分：erastin注射对肝脏中slc7a11和gpx4蛋白表达水平的影响及wb定量分析。i部分：erastin注射对脾脏中slc7a11和gpx4蛋白表达水平的影响及wb定量分析。

图2是体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究轻微脑梗死的动物模型的结果图，以上结果为6次独立重复实验平均值。其中a部分：对照组与erastin组小鼠大脑ttc染色的代表性图像；b部分：对照组与erastin组小鼠大脑组织存活面积的数据分析。

图3是体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究肾小球增大的动物模型的结果图，以上结果为3次独立重复实验平均值。其中a部分：对照组与erastin组小鼠肾脏he染色的代表性图像（放大1000倍）；b部分：对照组与erastin组小鼠肾小球体积的数据分析。

图4是体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究肠道绒毛增粗变高的动物模型的结果图，以上结果为6次独立重复实验平均值。其中a部分：对照组与erastin组小鼠肠道he染色的代表性图像（放大200倍）。b部分：对照组与erastin组小鼠绒毛高度的数据分析。

图5是体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究脾脏棕色物质沉积的动物模型的结果图，以上结果为6次独立重复实验平均值。其中上方为放大400倍，下方为放大1000倍。

图6是体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究脑、肾、肠、脾铁沉积增强的动物模型的结果图，以上结果为3次独立重复实验平均值。其中a部分：对照组与erastin组小鼠大脑普鲁士蓝染色的代表性图像（放大400倍）；b部分：对照组与erastin组小鼠肾脏普鲁士蓝染色的代表性图像（放大400倍）；c部分：对照组与erastin组小鼠肠道普鲁士蓝染色的代表性图像（放大400倍）；d部分：对照组与erastin组小鼠脾脏普鲁士蓝染色的代表性图像（放大400倍）。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行进一步的阐述。

实施例1体内铁死亡小鼠模型构建方法实施例

使用购自生工生物工程(上海)股份有限公司的二甲亚砜（纯度≥99.7%）、聚乙二醇400（试剂级）、吐温-80（试剂级），以质量百分比含量5%二甲亚砜+40%聚乙二醇400+5%吐温-80+50%生理盐水的配方配制溶剂，再将购自中国上海selleck有限公司的erastin（纯度99.65%）用此自制溶剂配制成100mg/ml的erastin悬浊液，将此erastin悬浊液以100mg/kg小鼠体重的剂量给标准条件下饲养的8周龄小鼠腹腔注射，每12h腹腔注射一次，共4次。注射4次erastin悬浊液后，小鼠表现为活力变差、聚集睡觉、采食量降低、体重停滞，但小鼠全部存活，没有出现死亡。

注射完最后一针6h后，对小鼠进行人道处死，取小鼠血清、肠道、肾脏、肝脏和脾脏检测各种铁死亡的相关指标（铁死亡生物标志物ptgs2mrna水平，erastin靶标slc7a11蛋白水平，氧化应激指标：mda含量，抗氧化指标：gsh含量、gpx4蛋白水平，铁代谢指标：血清铁、总铁结合力）。与对照组相比，erastin组小鼠的血清铁含量和总铁结合力水平分别显著升高6.16倍和1.03倍（图1a-b）。与对照组相比，erastin组小鼠的肠道、肾脏、肝脏、脾脏中ptgs2mrna水平（铁死亡的生物标志物）分别显著升高2.17倍、2.89倍、3.90倍和2.24倍（图1c）。与对照组相比，erastin组小鼠的肠道、肾脏、肝脏中的mda含量分别显著升高1.58倍、1.94倍和2.25倍（图1d）。与对照组相比，erastin组小鼠的肠道、肾脏、肝脏中的gsh含量分别显著降低至36.22%、66.37%和60.26%（图1e）。与对照组相比，erastin组小鼠的肠道中的slc7a11和gpx4蛋白表达水平分别显著降低至77.28%和58.92%（图1f）。与对照组相比，erastin组小鼠的肾脏中的slc7a11和gpx4蛋白表达水平分别显著降低至65.70%和42.04%（图1g）。与对照组相比，erastin组小鼠的肝脏中的slc7a11和gpx4蛋白表达水平分别显著降低至37.29%和66.50%（图1h）。与对照组相比，erastin组小鼠的脾脏中的slc7a11和gpx4蛋白表达水平分别显著降低至29.67%和63.46%（图1i）。以上结果说明体内铁死亡小鼠模型建立成功。

实施例2体内铁死亡小鼠模型应用实施例

根据实施例1中的构建方法，成功构建体内铁死亡小鼠模型后，对小鼠进行人道处死，取小鼠大脑、肾脏、肠道、肝脏和脾脏进行检测。

结果分析一、体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究轻微脑梗死的动物模型

取体内铁死亡小鼠模型大脑进行ttc染色（白色部分显示梗死，红色部分为存活的大脑），与对照组相比，erastin组小鼠的大脑出现轻微脑梗死，大脑组织的存活面积显著降低至88.74%（图2）。

结果分析二、体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究肾小球增大的动物模型

取体内铁死亡小鼠模型肾脏进行he染色，与对照组相比，erastin组小鼠的肾脏中肾小球显著增大，肾小球体积显著增大1.76倍（图3）。

结果分析三、体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究肠道绒毛增粗变高的动物模型

取体内铁死亡小鼠模型进行he染色，与对照组相比，erastin组小鼠的肠道中的绒毛结构显著变粗增高，绒毛高度显著增大1.22倍（图4）。

结果分析四、体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究脾脏棕色物质沉积的动物模型

取体内铁死亡小鼠模型脾脏进行he染色，与对照组相比，erastin组小鼠的脾脏中出现大量的棕色物质（图5）。

结果分析五、体内铁死亡小鼠模型可用于作为研究脑、肾、肠、脾铁沉积增强的动物模型

取体内铁死亡小鼠模型大脑、肾脏、肠道和脾脏进行普鲁士蓝染色（蓝点为铁沉积），与对照组相比，erastin组小鼠的大脑（图6a）、肾脏（图6b）、肠道（图6c）和脾脏（图6d）中铁沉积增多。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形和等同替换。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形和等同替换，均在本发明的保护范围之内。