一种红日椒草组织培养繁殖方法与流程

本发明涉及植物组织培养
技术领域：
，尤其涉及红日椒草的培养繁殖方法。
背景技术：
：红日椒草是胡椒科豆瓣绿属(peperomiagraveolens)多年生常绿肉质植物，原产于南美洲的热带地区，植株矮小，高5～8厘米，全株呈肉质，除叶面为暗绿色外，其它部分均为暗红色。肥厚多肉的叶片长椭圆形，对生或轮生，具短柄，叶片两边向上翻，使叶面中间形成一浅沟，背面呈龙骨状突起。叶面光亮，稍呈透明状。宜温暖、干燥的半阴环境，耐干旱，不耐寒，忌烈日曝晒、过分浇水和过分荫蔽，在光线明亮又无直射阳光处生长良好。红日椒草株形小巧秀气，叶色奇特，能在室内条件下正常生长，可作小型观叶植物栽种，点缀几案、窗台等处，精巧别致，独具特色。作为室内植物，红日椒草是比较受到大众欢迎的，购买需求不错，但是其组培过程比较容易发黑、生根困难，导致生产应用受到制约，不能很好地量产化。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种红日椒草组织培养繁殖方法，以解决红日椒草组培容易出现发黑、生根困难的问题。为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：一种红日椒草组织培养繁殖方法，包括如下步骤：(1)外植体处理：整个植株切下，茎干和叶片分开，均作为外植体备用；(2)外植体消毒与接种：选取红日椒草的茎段或叶片作为外植体，用含有吐温的升汞对外植体进行消毒；外植体接种到启动诱导培养基1进行培养，使外植体萌发；(3)启动诱导：外植体萌发后，将之转接到新鲜的启动诱导培养基中进行继代培养；(4)增殖扩繁：将步骤(3)得到的丛芽团切成小芽团，转接到增殖扩繁培养基；(5)壮苗成苗：将步骤(4)得到的丛芽团切成小芽团，转接到壮苗成苗培养基；(6)生根诱导：将步骤(5)得到的团块苗切成小芽团，转接到生根诱导培养基中。进一步地，所述步骤(1)外植体处理详细过程包括：从距离基质表面1-2cm处把整个植株切下，从叶柄基部环切茎干上的叶片或叶柄，切割过程中避免切伤侧芽和茎干，茎干和叶片分开，茎干切成单节段，节间短的切成2-3个节的节段。进一步地，所述步骤(2)的消毒时间是：外植体为上部茎段，0.1％升汞消毒4-6min；外植体为下部茎段0.1％升汞消毒5-8min；升汞消毒时，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放，升汞消毒时间到目标时间一半时，倒掉废升汞更换新升汞，升汞液位淹没外植体，消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放；消毒结束，用无菌水充分清洗干净外植体。进一步地，所述步骤(2)接种时，若外植体是茎段，镊子紧夹茎段，手术刀小心切去茎段两端，切口厚2mm，用镊子从接种碟中夹住茎段形态学上部插入到启动诱导培养基1中，插入培养基深度3mm，每瓶接种一个外植体；若外植体是叶片，把叶片横切成1/2，然后正面朝上平放到启动诱导培养基1表面。进一步地，所述步骤(3)启动诱导期继代培养以达到生长旺盛顶点时为准，即芽长得足够多，满瓶又未处于衰竭时为宜，培养代数及转接周期为：1～4代，30d～45d。进一步地，所述步骤(3)启动诱导中所用的培养基包括启动诱导培养基2、启动诱导培养基3，培养周期均是30～45天；所述启动诱导培养基1、启动诱导培养基2、启动诱导培养基3均是2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2；启动诱导培养基1的培养条件是26℃，散光培养，3000-4500lx，16h光/8h暗；启动诱导培养基2的培养条件是26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h；启动诱导培养基3的培养条件是26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h。进一步地，所述步骤(2)中，启动诱导培养基1培养30～45天后，外植体萌发；所述步骤(3)中，经过启动诱导培养基1培养，外植体萌发后，将之转接到新鲜的启动诱导培养基2，转接时去掉黑头；启动诱导培养基2培养后，再继续转接到启动诱导培养基3，转接时，将产生的丛芽切分成2-3芽/团，去黑头、枯黄叶；进一步地，所述步骤(4)中，经过步骤(3)启动诱导培养的芽长满瓶，达到生长旺盛顶点时，需进行转接，转接时切割要求如下：1)去黑头；2)去玻璃化的愈伤、芽；3)丛芽切割成2-3芽/团，方向性切割；4)较长的芽(≥6个节)，从中间切断，进行单株增殖；5)茎长成一片的，纵向分割成2-4块；切完，转接至增殖扩繁培养基；所述增殖扩繁期培养基及培养条件是：2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2，12团/瓶，26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h，培养30-45天。进一步地，所述步骤(4)培养后，转接至壮苗成苗培养基培养，转接时，切割要求：1)去黑头；2)去玻璃化的愈伤、芽；3)丛芽切割成2-3芽/团，方向性切割；4)较长的芽(≥6个节)，从中间切断，进行单株增殖；5)茎长成一片的，纵向分割成2-4块不等。所述壮苗成苗培养基为2#ms+ac0.2g/l或者2#ms+iaa0.1mg/l，培养基中除基本培养基和激素外，均添加30g/l蔗糖和6g/l卡拉胶，ph＝6.2；壮苗成苗期的培养条件是26±1℃，3000lx光培养，12h光/12h暗，培养周期是30-45天。进一步地，所述步骤(5)培养后，转接到生根诱导培养基培养，切割要求：4)保持团块的前提下，尽量把黑头去干净，把基部的愈伤组织尽量切去；5)3芽/团，如切分后会产生单株，也可4-5芽/团；6)有明显的叶，且叶展开；所述生根诱导培养基是2#ms+ac0.5g/l或者2#ms+ac1.0g/l或者2#ms+ac0.2g/l；生根诱导培养基除基本培养基和激素外，还添加30g/l蔗糖，ph为6.2；培养条件是26℃，3000lx光培养，12h光/12h暗，培养周期是20-30天。本发明与现有技术相比具有以下优点：(1)用加有吐温的0.1％升汞对外植体进行消毒，能够对组培成功率有积极作用；(2)外植体可以采用茎段、叶片；(3)经过外植体接种处理、启动诱导期多次转接培养能够利于获得保持母本优良性状的组培苗，增殖扩繁率高；(4)在生根诱导之前添加壮苗成苗培养能够提高生根率，且能够获得更好的植株生长状态，杆壮芽少生根率高。附图说明此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：图1是外植体萌发的实验图片；图2是启动诱导期间获得的红日椒草1代苗的实验图片；图3是增殖扩繁期组培效果实验图片；图4是壮苗成苗期转接到含有2#ms+ac0.2g/l培养基的实验图；图5是壮苗成苗期转接到含有2#ms+ac0.2g/l培养基的培养效果实验图；图6是壮苗成苗期转接到含有2#ms+iaa0.1mg/l培养基的实验图；图7是壮苗成苗期转接到含有2#ms+iaa0.1mg/l培养基的培养效果实验图；图8是芽太多，纤细，无根的不合格组培苗实验图；图9是无根，基部黑腐的不合格组培苗实验图；图10是hr20、hr19、hr24接种实验图；图11是hr20、hr19、hr24培养效果实验图。具体实施方式下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。首先，对本发明中出现的相关名词作简要说明：1、本发明中1#ms培养基是指：kno3和nh4no3浓度是ms培养基配方中kno3和nh4no3的浓度的1/2，其他成分与ms培养基的相同；2、本发明中2#ms培养基是指：kno3和nh4no3浓度是ms培养基配方中kno3和nh4no3的浓度的1/4，其他成分与ms培养基的相同；3、ms培养基、1#ms培养基、2#ms培养基的配方是：4、本发明中出现在培养基之后的“+”(例如“2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l”)表示该培养基包含“+”之后所列举的一种或多种物质(例如上述kt、iaa)。5、操作过程中的细节如使用的工具，外植体消毒仪器操作等是常规操作，本领域技术人员均能够理解，本文不一一赘述。本发明的红日椒草组织培养方法步骤如下：stg0母本预处理选取生长健壮、无病虫害、遗传性状纯正的母株，放干燥通风处晾干几天，不浇水，防淋雨，使基质变干至表层灰白。stg1外植体消毒与接种1.1外植体预处理选晴天，从距离基质表面1-2cm处把整个植株切下，将切割好的所有植株(外植体)整齐散开摆放到干净的接种碟或铺有报纸的塑料筐上备用。1.2外植体细处理将预处理好的外植体从叶柄基部环切茎干上的叶片或叶柄，注意切割过程中避免切伤侧芽和茎干，从茎干顶部茎节开始，一直处理到茎干基部茎节，如果茎干表面有残留老叶或老皮或其他残渣污垢，需要用消毒好的手术刀小心刮净，刮净处理中尽量避免刮伤茎干表皮，当处理完一整个茎干后，将茎干和叶片分别放到干净的接种碟中备用。1.3外植体消毒将细处理好的外植体茎干切成单节段，节间很短的也可以切成2-3个节的节段，根据茎段粗细规格不同将茎段分别分级夹放到不同的干净广口瓶中备用消毒，叶片可以直接根据大小和老嫩程度不同夹放到不同的广口瓶中备用，一个广口瓶中外植体的堆放一般不超过70％的容量。取加有2～3滴吐温的0.1％升汞瓶、若干个干净的广口瓶备用，倒入备用好的升汞到外植体材料瓶中，升汞液位必须淹没外植体，旋紧外植体材料瓶盖用力摇动几次，在升汞消毒过程中，每隔2-3分钟用力摇动外植体材料瓶，使外植体和瓶内壁充分被升汞消毒彻底，每次快速摇动7-8次后，将外植体材料瓶轮流正放和倒放，当升汞消毒时间到目标时间一半时，倾倒出废升汞到一个备用的空广口瓶中，当外植体材料瓶内升汞倒出完毕后，重新加入新升汞到淹没外植体液位为止，盖紧外植体材料瓶盖继续消毒，消毒过程中同样每隔2-3分钟用力摇动7-8次外植体瓶，并使外植体材料瓶正反轮番颠倒放置消毒碟中，消毒过程中，准备好8瓶左右无菌水备用，当升汞的消毒时间结束时，快速倾倒出废升汞到备用的空广口瓶中存放，往外植体材料瓶中加入无菌水，轻轻摇动清洗外植体和瓶内壁，摇动清洗2分钟左右后，倒出清洗过无菌水到一个空广口瓶中存放，然后再打开第二瓶无菌水盖子，把无菌水倾倒入外植体材料瓶后轻轻摇动清洗外植体，清洗2分钟左右后倒出清洗过的无菌水到一个空广口瓶中存放，如此清洗7次左右后，外植体消毒清洗处理完毕，最后一次清洗的无菌水保留在外植体材料瓶中不用倒出。消毒时间：外植体为上部茎段0.1％升汞消毒4-6min，外植体为下部茎段0.1％升汞消毒5-8min，该消毒方式可使组织培养成功率处于30％-80％。1.4外植体接种用枪形镊子从外植体材料瓶中夹取一个外植体茎段到接种碟中，镊子紧夹茎段，手术刀小心切去茎段两端切口厚约2mm，用镊子从接种碟中夹住茎段形态学上部插入到启动诱导培养基1中，插入培养基深度约3mm，每瓶接种一个外植体。如果外植体是叶片，应该把叶片横切成1/2，然后正面朝上平放到培养基表面。启动诱导培养基1：2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2；培养条件：26℃，散光培养，3000-4500lx，16h光/8h暗。一星期后，挑去真菌细菌污染的外植体。经常查看，观察外植体生长情况，如发现外植体除芽点外其余部分变成白色，说明消毒时间过长，应当缩短消毒时间。30～45d后，外植体萌发，其中一个外植体长芽情况如图1所示。stg2启动诱导期外植体萌发后，将之转接到新鲜的启动诱导培养基2，转接时去掉黑头。启动诱导培养基2：2#ms(1#)+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2；26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h。培养25d后，得到如图2所示的红日椒草1代苗。培养45d后再继续转接到启动诱导培养基3，将产生的丛芽切分成2-3芽/团，去黑头、枯黄叶。启动诱导培养基3：2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2；每瓶数团。培养条件：26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h，培养45d。启动诱导期培养以达到生长旺盛顶点时为准，即芽长得足够多，满瓶又未处于衰竭时为宜。所以不局限于上述继代培养，可以根据生长状态调整培养代数。而且根据培养代数不同，转接周期也会发生变化：1～4代，30d～45d。红日椒草很容易褐化，且该褐化会造成组培苗死亡或生长不良，与培养基接触的茎基部容易变成黑头，阻碍生长，需要及时转接，培养周期不宜超过45d。stg3增殖扩繁期当stg2启动诱导期培养的芽长满瓶，达到生长旺盛顶点时，需进行转接，转接时切割要求如下：1、去黑头；2、去玻璃化的愈伤、芽；3、丛芽切割成2-3芽/团，方向性切割；4、较长的芽(≥6个节)，从中间切断，进行单株增殖；5、茎长成一片的，纵向分割成2-4块不等。切完，转接至增殖扩繁培养基：2#ms+kt0.1mg/l+iaa0.1mg/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶，ph＝6.2；12团/瓶，26℃，3000lx光培养，光12h/暗12h，培养周期是30-45天。扩繁期增殖率可达：200％；效果如图3所示。stg4壮苗成苗期为了获得更粗壮的生根苗，从而进行生根预处理，转接时切割要求如下：1、去黑头；2、去玻璃化的愈伤、芽；3、丛芽切割成2-3芽/团，方向性切割；4、较长的芽(≥6个节)，从中间切断，进行单株增殖；5、茎长成一片的，纵向分割成2-4块不等。壮苗成苗培养基：2#ms+ac0.2g/l；或者2#ms+iaa0.1mg/l；每瓶接15团。培养基中除基本培养基和激素外，均添加30g/l蔗糖和6g/l卡拉胶，ph＝6.2；培养条件：26±1℃，3000lx光培养，光周期：12h光/12h暗，培养30-45d。如图4所示，为转接到2#ms+ac0.2g/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶培养基中的实验图，培养效果如图5所示。如图6所示，为转接到2#ms+iaa0.1g/l+30g/l蔗糖+6g/l卡拉胶培养基中实验图，培养效果如图7所示，两种培养基培养的结果均是：株高多为1～1.5cm；长气生根，叶片绿。因此，若茎秆纤细，为避免最后得到的组培苗出现如图8所示的芽太多，纤细，无根的情况，可以在生根诱导期之前添加壮苗成苗期，把杆养壮。stg5生根诱导期转接时，切割标准如下：1、保持团块的前提下，尽量把黑头去干净，把基部的愈伤组织尽量切去，以提高生根率，避免出现如图9所示虽然长得较粗壮但是无根，基部黑腐的情况；2、3芽/团，如切分后会产生单株，也可4-5芽/团；3、有明显的叶，且叶展开。生根诱导期有三种可选的生根诱导培养基：培养基代码培养基主要成分生根率hr192#ms+ac0.5g/l100％hr202#ms+ac1.0g/l100％hr242#ms+ac0.2g/l100％生根诱导培养基除基本培养基和激素外，均添加30g/l蔗糖，ph为6.2。每瓶接25团。培养条件：26℃，3000lx光培养，光周期：12h光/12h暗，20-30天。hr20接种实验图如图10的左图所示，hr19接种实验图如图10的中图所示，hr24接种实验图如图10的右图所示。hr20培养效果如图11的左图所示，hr19培养效果如图11的中图所示，hr24培养效果如图11的右图所示。从植株的整体生长状态来看，hr24的培养效果是当中最好的。以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。当前第1页12