一种圆锥绣球的离体芽培养方法与流程

本发明涉及植物培养技术，特别涉及一种圆锥绣球的离体芽培养方法。

背景技术：

圆锥绣球(hydrangeapaniculatasieb.etzucc)是虎耳草科绣球属植物，落叶灌木。枝暗红褐色或灰褐色。叶纸质，2-3片对生或轮生，卵形或椭圆形，叶缘有细锯齿且叶背具毛。圆锥绣球花大且美丽，花形奇特，长达30-40cm，花期7-10月，花期长，颜色可人。原产于日本及中国四川一带。从18世纪引入欧洲以来被广泛应用和研究，是一种高档花卉，但在国内还未普及。可种植于庭院中做花篱、花镜，也可将花球剪下，瓶插室内，具极高观赏价值。不仅如此，经相关研究表明圆锥绣球提取物还有一定的药用价值。圆锥绣球种子极微小，存在复杂休眠机制，由于用种子繁殖难度较大，大多采用扦插和压条等传统的繁殖方式，但繁殖系数不高。而组培技术是利用少量的外植体在人工配制的培养基上，给予适当培养条件从而获得大批优质苗的过程。

对于绣球离体培养方面的研究主要有：陆乙卜等(2015)报道了圆锥绣球种子离体萌发的培养条件，试验材料为野生圆锥绣球的种子，种子繁殖的苗木为实生苗，离体芽培养得到的是无性繁殖苗，所以组培方法不同。李奕萱等(2017)报道了大花木绣球组织培养体系，大花木绣球虽名为绣球，实则为忍冬科荚迷属植物，与圆锥绣球为不同科的植物；蒋梦烟(2017)报道了绣球品种‘蓝尼康’快繁技术研究，以茎尖为外植体，适宜的腋芽诱导培养基为ms+6-ba1.0mg/l，出芽率为92.5％，平均出芽个数为3.3个。适宜的生根培养基为ms+iba1.0mg/l，平均生根时间为6.7d，生根长度为2.0cm。而‘蓝尼康’为大花绣球，在分类学上大花绣球与圆锥绣球为不同种，无论植株的表型特征还是生长特性、抗逆性等方面差异均较大。

关于圆锥绣球‘粉色精灵’的离体芽培养技术研究目前未见相关报道。

技术实现要素：

发明目的：本发明目的是提供一种灭菌效果好、腋芽诱导率高、繁殖系数高、生根率高的圆锥绣球的离体芽培养方法。

技术方案：本发明提供一种圆锥绣球的离体芽培养方法，包括如下步骤：

(1)外植体的采集：于4-6月份，选取幼嫩带芽茎段作外植体，进行修剪，保留顶芽和腋芽；

(2)外植体消毒灭菌：外植体分别在洗衣粉中浸泡、流水下冲洗、多菌灵和链霉素混合液中浸泡、无菌水冲洗，后进行表面消毒：75％酒精浸泡、无菌水冲洗、hgcl2溶液浸泡、无菌水冲洗；

(3)启动培养：将经过消毒灭菌的外植体两端切口处做修剪，剪成带芽茎段，直立式接种于启动培养基上；

(4)增殖培养：将经过启动培养的组培苗，剪成带芽茎段，减掉可接触到培养基的叶片，垂直接种于增殖培养基中；

(5)生根培养：增殖培养后，将组培苗基部进行修剪，转入生根培养基进行根的诱导。

进一步地，所述步骤(1)中的外植体取自粉色精灵品种。

进一步地，所述步骤(1)中的外植体为当年生幼嫩内膛枝。

进一步地，所述步骤(2)外植体消毒灭菌：将外植体在洗衣粉中浸泡15min，流水下冲1.5-2h，2g/l多菌灵和0.6g/l链霉素浸泡8min，用无菌水冲净；再进行表面消毒：75％酒精浸泡1min，无菌水冲1-2次，0.1％hgcl2浸泡5min，无菌水冲洗3-5次。灭菌效果最好，褐化率为0％，污染率为5％。

进一步地，

所述步骤(3)的启动培养基的配方为：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1-0.2mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.8。萌芽率可达100％。

进一步地，所述步骤(4)的增殖培养基的配方为：ms+6-ba1.0-1.5mg/l+naa0.1-0.15mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖30g/l，ph值为5.8。增殖系数最高可达7，且苗生长健壮。

进一步地，

所述步骤(5)生根培养基为：1/2ms+6-ba0.05mg/l+iba0.1mg/l+naa0.1mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖20g/l，ph值为5.8。

有益效果：本发明的圆锥绣球‘粉色精灵’的离体芽培养技术具有褐化率低，污染率低，灭菌效果好的特点：褐化率可达0％，污染率可低至5％。启动效果好：萌芽诱导率达100％，增殖阶段繁殖率高：增殖系数达7，生根苗健壮：生根率达100％，平均根量达22条，平均根长3.10cm。

附图说明

图1为相同剂量杀菌剂和升汞不同处理时间对外植体消毒效果柱状图；

图2为启动培养过程图，其中a图为接种、b图为芽诱导、c图为培养后期状况；

图3为增殖培养过程图，其中a图为健壮苗、b图为高增殖系数图；

图4为生根培养过程图，其中a图为前期、b图为后期。

具体实施方式

1.材料：圆锥绣球品种之一‘粉色精灵’，选择当年生幼嫩茎段的顶芽和腋芽。

2.方法与步骤：

2.1外植体采集：时间选择在4-6月份，天气晴朗湿度适宜条件下，选择品种为‘粉色精灵’。选择生长健壮、无病虫害和腋芽饱满的春梢枝段为材料。采集外植体时最好采取当年生幼嫩內膛枝，这样避免对植株造成不必要的损失。采集完后立即把剪口部分放进装水的容器中，防止失水失活，之后应及时进行处理、接种。

2.2材料预处理：将采集来的‘粉色精灵’枝段进行修整，去掉叶片留些叶柄，剪切成2cm左右小段，每段至少保留1-2个腋芽。事先准备好干净的烧杯，然后将剪好的小段放在洗衣粉中浸泡15min，流水下冲洗1.5-2h，2g/l多菌灵和0.6g/l链霉素浸泡8min左右，之后用无菌水冲净。

2.3材料表面灭菌：对材料进行预处理之后，将茎段放入超净工作台中。75％酒精处理1min左右，无菌水冲洗1-2次，0.1％hgcl2处理5min左右，无菌水冲洗3-5次。处理时应不断摇晃无菌瓶，使灭菌更加彻底。试验采用双因素完全随机组合试验设计，试验因素分别为：杀菌剂2g/l多菌灵和0.6g/l链霉素混合溶液的处理时间(0、5、8、12min)，hgcl2的处理时间(3、5、10min)，ph值调整为5.8，共12个处理，每个处理20瓶培养基，每瓶接2个外植体，重复4次。

2.4培养条件：培养室中培养温度为(25±2)℃，室内相对湿度70-80％，光照强度保持在2000-3000lx，培养时间控制在每天12h。

2.5启动培养：用酒精擦拭双手进行灭菌，将经过表面灭菌处理的茎段两端切口处稍做修剪，修剪成1.5cm左右的带芽茎段，垂直接种到培养基，接种深度以插到培养基中部为宜，不宜插入过深。基本培养基选用ms培养基，激素种类和浓度采用双因素完全随机组合试验设计，6-ba(0、0.5、1.0、2.0mg/l)和naa(0、0.15、0.2、0.5mg/l)，ph值调整为5.8，浓度搭配16个处理，每个处理15瓶，每瓶接种2个外植体，重复4次。

2.6增殖培养：将经过启动培养25d生长的组培苗，截取成1.5cm左右的带芽茎段，稍作修剪，将茎段下部分有可能接触到培养基的部分减掉，垂直接种于增殖培养基中。培养基选用ms基本培养基，并采用双因素完全随机试验，加入不同浓度的6-ba(1.0、1.5、2.0mg/l)和naa(0.1、0.15、0.5mg/l)，ph值调整为5.8，总共9个处理，每个处理20瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次。

2.7生根培养：增殖培养20d后，将较健壮的组培苗取出，转入到生根培养基中进行组培最后一步根的诱导。培养基选用1/2ms基本培养基，采用三因素试验设计，6-ba(0、0.05、0.1mg/l)，iba(0、0.1、0.2mg/l)，naa(0.05、0.1、0.2mg/l)，ph值调整为5.8，共5个处理，每个处理10瓶，每瓶接种2个外植体，重复3次。

2.8数据记录及分析：对灭菌、启动培养、增殖培养、生根培养四个阶段的生长情况进行记录，并对数据进行处理。

2.8.1相同剂量杀菌剂和升汞不同处理时间对外植体灭菌效果影响：接种25d左右后观察记录污染率和褐化率(见表1)。

表1相同剂量杀菌剂和升汞不同处理时间对外植体灭菌效果影响表

使用excel对上述数据进行分析，见图1。

由图1可见当处理号8时，污染率和褐化率都是最低，分别为5％和0％，此时的杀菌剂混合溶液灭菌时间为8min，升汞灭菌时间为5min。

2.8.2不同浓度激素配比对腋芽诱导影响：25d左右后记录生长状况和计算腋芽萌发率(见表2)。

表2不同浓度生长激素配比对腋芽诱导影响表

使用spss25.0对上述数据进行分析，结果见表3。

表3不同浓度生长激素配比对腋芽诱导影响方差分析表

对上述结果进行多重比较，结果见表4。多重比较结果得出：6-ba浓度对腋芽诱导影响极显著，naa浓度对腋芽诱导显著。在不同的激素配比的方差分析和多重比较结果中得出，在比较萌芽率的各处理间差异性时，当6-ba浓度为0.5mg/l效果最好，naa0.5mg/l时效果最差，而naa浓度在0.1mg/l-0.2mg/l之间差异不显著，因此，适宜腋芽诱导的启动培养基为ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1-0.2mg/l，萌芽率最高可达100％。

表46-ba与naa对腋芽诱导效果的多重比较表

2.8.3不同浓度激素配比对增殖效果影响：20d左右后记录生长状况和计算增殖系数(见表5)。

表5不同浓度生长激素配比对增殖效果影响表

使用spss25.0对上述数据进行分析，结果见表6。

表6不同浓度生长激素配比对增殖效果影响方差分析表

对上述结果进行多重比较(见表7)得出：6-ba浓度对增殖影响显著，naa浓度对增殖影响较显著。在不同的激素配比中可以发现，在比较增殖系数的各处理间差异性时可以发现：当6-ba浓度为1.0-1.5mg/l，naa为0.1-0.15mg/l时效果最好，增殖系数最高为7。当naa浓度为0.5mg/l时，增殖系数低，愈伤组织膨大，说明该浓度不利于芽的增殖。

表76-ba与naa对增殖的影响的多重比较表

2.8.4不同浓度激素配比对生根效果影响：30d后统计和计算生根率，记录根数和根长(见表8)。

表8不同浓度生长激素配比对生根效果影响表

由表8可得：6-ba对叶片健康状况有影响，当浓度为0mg/l时，叶片极其枯黄。iba对生根长度有影响，当浓度较低时，根长较短。naa对生根率以及生根长度均有影响，当浓度较低，生根不明显，浓度较高时，愈伤组织膨大，根系粗壮，但萌芽极差。

综上所述：洗衣粉中浸泡15min，流水冲洗1.5-2h，2g/l多菌灵和0.6g/l链霉素浸泡8min左右，用无菌水冲净，将茎段放入超净工作台进行表面消毒，75％酒精浸泡1min左右，无菌水冲1-2次，0.1％升汞浸泡5min左右，无菌水冲洗3-5次，灭菌效果最好，褐化率为0％，污染率为5％。启动培养基配方为：ms+6-ba0.5mg/l+naa0.1-0.2mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖30g/l，萌芽率达100％。最适增殖培养配方为：ms+6-ba1.0-1.5mg/l+naa0.1-0.15mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖30g/l，增殖系数最高可达7。最适生根培养基为：1/2ms+6-ba0.05mg/l+iba0.1mg/l+naa0.1mg/l+琼脂6.8g/l+蔗糖20g/l，生根率达100％，平均根量达22条，平均根长3.10cm。