本发明属于植物栽培领域，具体涉及一种集约化生产槲蕨种苗的方法。所述方法通过控制常规孢子繁育条件，能够在较短时间内及相应的生产设施条件下，低成本、操作简便、高效获得槲蕨种苗，实现槲蕨种苗的产业化生产。
背景技术：
槲蕨(drynariaroosiinakaike)属于水龙骨科polypodiaceae槲蕨亚科drynarioideae槲蕨属drynaria，是一种极为特化而典型的附生蕨类植物。槲蕨为传统中药材，其根状茎以骨碎补入药，具有活血化淤、补肾强骨、续伤止痛之功效，被收载于《中国药典》。
随着近年来市场需求量不断扩增，致使野生槲蕨资源过度采挖，价格连年上涨；同时造成大量水土流失、植被破坏，对生态造成毁灭性的影响。因此，开展槲蕨人工繁殖技术研究与规模化生产迫在眉睫。
槲蕨采取传统的切段、分株繁殖效率较低，组织培养繁殖成本又较高，难以获得大量且质优的商品种苗。而通过高效的常规孢子播种繁育途径，能够在短期内获得大量种苗实现槲蕨的产业化种植，但常规孢子繁殖容易受繁育条件的影响，造成孢子体成苗率低及周年生产的问题。
技术实现要素：
本发明的一个目的是提供一种槲蕨种苗集约化繁育方法，所述方法通过控制孢子质量、播种、培育以及分苗过程中的具体条件，可显著提高成苗率，并且具有低成本，操作简便且高效的效果，可实现槲蕨种苗的产业化生产。
具体地，本发明提供一种槲蕨种苗集约化繁育方法，其包括以下步骤：
(1)制备混合基质：将泥炭藓、蛭石和细沙按体积比10：(1-3)：(1-5)混合，加水使基质含水量为40-50％，灭菌，得所述混合基质，装入穴盘待用；
(2)播种：将槲蕨孢子加水避光浸泡48-72小时，制备孢子悬液，按照200-800粒/cm2的播种量均匀播种至步骤(1)所述穴盘中混合基质的表面；
(3)培养：将步骤(2)播种后的穴盘置于温室潮汐苗床上进行培养，配子体成熟后将基质浸透水1次；其中，所述培养条件为：将苗床上方覆盖通风、透光且不易凝结水珠的材料；保持基质湿润；控制空气相对湿度80-100％，最低环境温度为12℃，最高环境温度为26℃；优选地，控制昼夜温差10℃以上。
步骤(1)：制备混合基质
播种所用基质要求疏松透气、排水良好，不板结。经大量实验对比，本发明配制的混合基质相较于其它基质更适合槲蕨孢子生长。
本发明提供下述方法制得的混合基质：将泥炭藓、蛭石和细沙按体积比10：(1-3)：(1-5)混合，加水使基质含水量为40-50％(优选50％)，灭菌，得所述混合基质，装入穴盘待用。
在一些实施方案中，所述混合基质用作孢子播种、配子体生长和/或孢子体生长基质。在一些实施方案中，所述混合基质中泥炭藓、蛭石和细沙体积比为10：1：4。
相较于其它品牌和其它基质，丹麦品氏托普泥炭藓规格标准较均一，杂质少，发苗快且苗长势较均一。因此，在一些实施方案中，本发明所述泥炭藓指丹麦品氏托普泥炭藓(例如长度规格为0-6mm的泥炭藓)。在一些实施方案中，所述蛭石粒径为12-24目(例如，0.8-1.2mm)。在一些实施方案中，所述细沙粒径为70-180目。
在一些实施方案中，所述灭菌为高压灭菌，优选的方法为：将所述基质置于高压灭菌锅于120-125℃(例如121℃)，103-105kpa(例如103.4kpa)处理40-50min，任选的，还包括将高压灭菌后的基质用50％灭蝇胺可溶性粉剂1000倍稀释液处理，密封存放12-48小时(例如24小时)的步骤。在一些实施方案中，可将所述基质分装于棉布袋中进行所述高压灭菌以保证灭菌的彻底性。在一些实施方案中，所述灭蝇胺稀释液与基质的体积比为1：50-200，例如1：50，1：100，1:150或1：200。温室蚊虫较多，其它杀虫剂喷施防治有限，灭蝇胺可有效防止蚊蝇在基质中产卵，孵化幼虫，从而降低对配子体以及孢子体的影响。
在一些实施方案中，将所述混合基质装入穴盘后，在播种前，还包括用经软化处理ec值小于60us/cm的水浸透的步骤。
对于所用穴盘，本发明没有特别限定，只要能实现要求的技术效果即可。在一些实施方案中，本发明特别优选市售标准穴盘，例如，ps、pvc或pe塑胶穴盘。在一些实施方案中，优选长44cm，宽28cm的200孔穴盘作为播种以及后续第一次分苗所用器皿。一方面，可充分利用苗床的空间达到生产最大化。另外，在播种以及后续分苗时可利用标准穴盘的独立空间，杜绝后期配子体阶段发生霉变传染连片的可能。而且，分苗阶段1分为4或1分为8标准均一，操作简便节省人工。
在一些实施方案中，在步骤(2)中将所述混合基质装入穴盘前，还包括将穴盘用0.5％高锰酸钾溶液浸泡15min-1h(例如30min)的步骤。
步骤(2)：播种
本发明的播种方法包括：将槲蕨孢子加水避光浸泡48-72小时(优选72小时)，制备孢子悬液，按照200-800粒/cm2的播种量均匀播种至步骤(1)所述穴盘中混合基质的表面。
在一些实施方案中，所述孢子悬液浓度为0.1-1mg/ml(例如0.5mg/ml)。
在一些实施方案中，按照200粒/cm2，300粒/cm2，400粒/cm2，500粒/cm2，600粒/cm2，700粒/cm2或800粒/cm2的播种量进行播种。经统计，槲蕨孢子5mg约为75000粒，经研究试验得出在一定范围内50-5000粒/cm2播种密度越大萌发率越高，但播种密度过大发育成配子体的量反而大大降低，经实验得出密度为400-500粒/cm2时为最佳，萌发的孢子约有10％形成配子体，且相互重叠。
在一些实施方案中，通过下述方法得到所述槲蕨孢子：收集成熟槲蕨孢子叶片，待孢子自然脱落，得到所述槲蕨孢子。在一些实施方案中，收集成熟槲蕨孢子叶片后，先剪除叶片上部1/4，再进行后续步骤。
在一些实施方案中，于春天(例如3-4月)或秋天(例如8-9月)收集成熟槲蕨孢子叶片。当年新鲜成熟的孢子活力最强，萌发率最高，因此，优选采用当年采收的槲蕨孢子进行播种。
在一些实施方案中，将收集得到的成熟槲蕨孢子叶片装入纸袋(例如硫酸纸袋)，置通风、阴凉处干燥使孢子自然脱落。
在一些实施方案中，在得到所述槲蕨孢子后，还包括除固体杂质的步骤，例如过200目筛。
在一些实施方案中，将所述槲蕨孢子在0-4℃(例如0℃)保存。
在一些实施方案中，将所述槲蕨孢子密封保存。例如，可装入密封容器(例如，密封袋、密封管等)中进行保存。
步骤(3)：培养
将步骤(2)播种后的穴盘置于温室潮汐苗床上进行培养，配子体成熟后将基质浸透水1次；其中，所述培养条件为：将苗床上方覆盖通风、透光且不易凝结水珠的材料；保持基质湿润；控制空气相对湿度80-100％，最低环境温度为12℃，最高环境温度为26℃；优选地，控制昼夜温差10℃以上。
在一些实施方案中，可将苗床上方覆盖白色无纺布(不选用玻璃或塑料薄膜)，以通风透光，不凝结水珠。另外，也可防止后期配子体阶段水滴落下造成配子体腐烂。
在一些实施方案中，孢子萌发后每10-15天(例如每15天)喷施1次氮磷钾复合肥，例如2000倍稀释的花多多复合肥营养液，更优选2000倍稀释的花多多1号(20-20-20)复合肥营养液。
孢子体苗过密不利于生长且容易造成腐烂，及时分苗可获得较大的生长空间。因此，本发明还包括分苗的步骤。在一些实施方案中，所述分苗在配子体受精后至孢子体出现第一片真叶时进行。
在一些实施方案中，在所述分苗前，还包括控水的步骤。控水程度以镊子插入基质提起后不散坨为标准。在一些实施方案中，在所述分苗前，控水至基质含水量为70-80％。
在一些实施方案中，分两次进行所述分苗，以使孢子体苗密度达到5-10株/16cm2。在一些实施方案中，每次分苗后还包括缓苗的步骤。
在一些实施方案中，第一次分苗使孢子体苗密度为8-15株/cm2(例如10株/cm2)。在一些实施方案中，第一次分苗时所用培养基质和/或穴盘与播种时所用基质相同。在一些实施方案中，第一次分苗完成缓苗后，每10-15天(例如每15天)喷施1次氮磷钾复合肥，例如2000倍稀释的花多多复合肥营养液，更优选2000倍稀释的花多多1号(20-20-20)复合肥营养液。在一些实施方案中，第一次分苗后培养条件为：将苗床上方覆盖通风、透光且不易凝结水珠的材料；保持基质湿润；控制空气相对湿度80-100％，最低环境温度为12℃，最高环境温度为26℃。在一些实施方案中，控制昼夜温差10℃以上。
在一些实施方案中，第二次分苗时机为孢子体苗高2-3cm时。在一些实施方案中，第二次分苗时选用泥炭藓(例如丹麦品氏托普泥炭藓，例如规格为10-30mm的丹麦品氏托普泥炭藓)作为培养基质。在一些实施方案中，第二次分苗完成缓苗后，每8-15天(例如10天)喷施1次氮磷钾复合肥以及包膜复合肥。在一些实施方案中，所述氮磷钾复合肥为1000倍稀释的花多多复合肥营养液，优选1000倍稀释的花多多1号(20-20-20)复合肥营养液。在一些实施方案中，所述包膜复合肥为奥绿1号缓释肥(14-14-14)。在一些实施方案中，第二次分苗后培养条件为：空气相对湿度80-100％，最低环境温度为10℃，最高环境温度为30℃。在一些实施方案中，控制昼夜温差10℃以上。
在一些实施方案中，播种、培养以及分苗所用的水均为ec小于60us/cm的软化水。ec(electricalconductivity)值可用于表示溶液中可溶性盐浓度，也可以表示液体肥料或种植介质中的可溶性离子浓度。其单位用ms/cm或mmhos/cm表示，测量温度通常为25℃。
在一些实施方案中，播种、培养以及分苗过程中不加辅助照明，利用自然光照。
发明的有益效果
本发明所提供的槲蕨种苗的生产繁育方法，是将当年采收的成熟槲蕨孢子均匀的且定量播种于混合配制的基质表面，在适宜的生产条件下进行科学的综合管控，最大化的形成孢子体苗，经过分苗移栽后获得槲蕨种苗。
本发明是以槲蕨的成熟孢子为播种材料，利用孢子繁殖技术手段，经过技术改良和创新，并结合科学的管理措施，建立的槲蕨常规孢子繁育种苗的方法。此方法解决了现有槲蕨孢子繁育种苗周期较长、播种密度不均一、成本高且成苗率低的瓶颈，开辟了槲蕨人工繁殖集约化生产的新途径。利用本发明的方法，定量称量孢子材料，采用合理均一的播种方法，在稳定适宜的条件下培养，恰当的分苗时机，短期内快速受精成苗(80-90天)，且成苗率高且长势均一，达95％以上。这将大大促进槲蕨产业化生产的进程，不仅能够满足市场对槲蕨原材料的需求，同时又保护了槲蕨野生资源惨遭破坏，为槲蕨进一步开发利用研究奠定了基础，具有广阔的应用前景。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
槲蕨种苗培育实验
1.槲蕨孢子的采集、处理及保藏
于每年春(3～4月份)、秋(8～9月份)两季采集成熟的槲蕨孢子叶片(成熟的标志为：孢子囊群呈橙黄色，囊群盖即将开裂时为最佳采收时期；孢子成熟是由叶片下部向上部逐渐成熟)，剪除叶片上部1/4部分后分别装入硫酸纸袋中置于通风、阴凉干燥处，2-3天后孢子自然干燥脱落，收集孢子过200目细筛装入20ml螺旋口盖的塑料离心管中，装入密封袋保存于0℃冰箱。
2.播种基质的选择与处理
按体积比选用丹麦品氏托普泥炭藓5份(长度规格0-6mm)、蛭石(粒径1mm)0.5份、细沙2份(取自内蒙古锡林郭勒正蓝旗沙漠沙丘除去表层的内部细沙，特点是沙粒细小均一、无杂质)均匀混合配制，喷水搅拌均匀使其含水量保持在40％左右，分装于长50cm直径20cm的棉布袋中(布袋过粗过大灭菌不彻底)置于高压灭菌锅121℃，40-50min灭菌处理，冷却后用50％灭蝇胺可溶性粉剂1000倍液喷洒并搅拌均匀，装入塑料口袋密封处理24h。
3.播种器皿的选择与处理
选用长44cm，宽28cm，厚度1.0mm的200孔穴盘作为播种器皿，用0.5％高锰酸钾液浸泡30min备用。
4.播种
把步骤2中的基质装入穴盘，穴盘的每个孔穴填满基质整平并且适当压实，浸透经软化处理ec值小于60的水，待用。提前2d统计当次所需播种的穴盘数，每个穴盘孢子播种量以25mg为最佳，约375000粒孢子，称量孢子总量加清水(25mg孢子+清水50ml)于手动压力喷壶(刻度)中，摇晃均匀后避光静置浸泡48h。播种前摇匀形成悬浊液喷洒于基质表面。
孢子计数方法：称取5mg纯净孢子，在体视显微镜下直接计数。
5.培养
孢子培养条件：播种后将穴盘均匀的摆放于温室(风机+水帘控温，遮阳率(内+外)70-80％)潮汐苗床(四周有边框)上，每平方米放6个穴盘，苗床上方覆盖0.5mm厚度白色无纺布保湿。温室条件管控：夏季最高温度控制在26℃以下，冬季最低温度控制在12℃以上；空气相对湿度80-100％，基质保持湿润即可。
配子体阶段管理：播种后约7-10d孢子开始萌发，基质保持湿润即可，配子体阶段每15天喷施1次2000倍花多多1号(20-20-20)复合肥营养液以促进生长；孢子萌发后70-80d左右配子体成熟浸透水1次，便于集中受精，统一发育成苗，成苗率在95％以上。
其中，成苗率计算方法为分别对单位面积内正常成熟的配子体以及受精后发育成苗的数量进行计数，并计算受精后发育成苗数与正常成熟的配子体数的比值，即为成苗率。
6.分苗
在配子体成熟受精后至孢子体苗出现第一片真叶时(孢子体苗高2-3mm)及时分苗移栽。分苗移栽前要适当控水，分苗时不易散坨，缓苗快。分苗选用的器皿和基质与播种所用相同。用镊子将每孔穴的孢子体苗整陀取出1分为4份的团苗(每份再均分4份分别栽种于每穴的4个点位，每个点位8-10株左右)分别栽种于200孔的穴盘中，浇透水后摆放于相同条件下的苗床上继续培养，缓苗后每15d喷施1次2000倍花多多1号(20-20-20)复合肥液。在苗高2-3cm时，每穴再次1分为4或1分为8，分栽于50孔的穴盘(基质选用单一的丹麦品氏托普泥炭藓，规格10-30mm，通透性强，发苗快)中移至栽培温室进行集中管理。
具体管理条件为：夏、秋高温季节需要加强通风，并适当遮阳降温，室温保持在30℃以下；冬季及早春寒冷季节白天温度保持在20℃以上，夜间温度10℃以上，栽培基质见湿见干，空气湿度80-100％，缓苗后每10d施用1次1000倍花多多1号(20-20-20)复合肥及奥绿1号缓释肥(14-14-14)，5粒/孔。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。