本发明涉及一种维持红细胞活性的保存液，特别涉及一种维持红细胞活性的体外保存溶液。
背景技术：
一氧化氮(no)微溶于水，在20℃的水中溶解度仅为5.6×10-3g/l(相当于0.186μmol/l)。血液红细胞中的一氧化氮具有重要作用，可以帮助机体适应缺氧状态，而缺氧是一种常见于高海拔和心血管疾病等的病理过程。
一氧化氮在红细胞的变形性和携氧释氧能力的维持中发挥作用。红细胞在液态保存时，血液中氧的亲和性逐渐增长而携氧量减少，细胞膜的脆性增加，究其原因是红细胞中一氧化氮的大量流失，从而导致红细胞变形能力以及血红蛋白携氧能力等生理活性降低甚至丧失。因此，制备富含一氧化氮的保存液有利于防止红细胞中一氧化氮的流失，维持红细胞在储存和运输过程中的完整形态和携氧活性。
已有报道的用于补充体内一氧化氮的方法多是应用一氧化氮供体化合物。一氧化氮供体化合物分为两类：非酶生型和酶生型。非酶生型一氧化氮供体化合物大部分来自硝基化合物，包括硝普盐、有机或无机亚硝酸盐和硝酸盐、亚硝胺、氮芥、联氨等，剂量小且毒副作用大。而酶生型一氧化氮供体化合物(如精氨酸)需要通过体内生物酶等作用分解产生出一氧化氮分子。以上这些一氧化氮供体化合物及其代谢产物会对机体组织产生不良反应，甚至存在毒副作用，因此不适宜在红细胞保存液中应用。
已有报道的红细胞保存液中没有包含一氧化氮气体，因此红细胞活性维持时间较短。目前尚未见到有包含一氧化氮气体的红细胞保存液的报道。因此，保持红细胞保存液中一氧化氮气体的有效浓度成为目前红细胞保存液质量提升的瓶颈。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的缺点(即：缺乏维持红细胞保存液中一氧化氮气体有效浓度的技术)，提供一种维持红细胞高活性的保存溶液，为保证红细胞的完整形态和携氧活性提供最大的保障，同时满足临床治疗的安全、有效、便捷、经济的要求。
本发明的维持红细胞活性的保存液包括红细胞基础保存液和一氧化氮纳米泡，一氧化氮纳米泡均匀地分散于红细胞基础保存液中。
上述的红细胞基础保存液中包括：肝素-泊洛沙姆50mg/l、甘氨酸6.0g/l、kh2po40.3g/l、na2hpo4·12h2o10.0g/l、碱性成纤维细胞生长因子10mg/l、甲氧苄啶15mg/l。
上述的红细胞基础保存液中进一步加入：糖、电解质盐、氨基酸、ph值缓冲剂、抗菌剂和抗氧化剂。
上述的一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成。
上述的一氧化氮纳米泡的粒径范围为500～900nm。
上述的一氧化氮纳米泡优选的粒径范围为600～800nm。
上述的一氧化氮纳米泡在红细胞基础保存液中的浓度为6×106～9×106个/ml。
上述维持红细胞活性的保存液的使用温度为0～37℃。
上述维持红细胞活性的保存液优选的使用温度为15～25℃。
上述维持红细胞活性的保存液用于在体外保存红细胞中的应用。
本发明的维持红细胞活性的保存液与现有的红细胞保存液相比，具有以下优点：①不使用任何一氧化氮供体化合物，不会因为一氧化氮供体化合物对机体组织产生不良反应和毒副作用；②一氧化氮纳米泡是由蛋黄磷脂为泡膜材料包裹一氧化氮气体形成的泡囊组成，对红细胞具有良好的亲和性和生物相容性；③保存液的使用温度范围较宽，满足医疗储存和运输的需要；④对于红细胞活性保持时间长，能最大程度地保持红细胞的生存能力和生物学活性。
具体实施方式
下文将详细描述本发明具体实施例。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。
实施例1红细胞保存液的制备
实验组的维持红细胞活性的保存液的制备如下：
(1)一氧化氮纳米泡的制备：5ml甘油和45ml磷酸盐缓冲液混合，加热至65℃，加入蛋黄磷脂，混匀后转入具塞保温耐压容器中，抽真空后注入一氧化氮气体，通过漩涡混合器高速振荡3min，高压通过规定孔径筛网进行粒径均化处理，即得一氧化氮纳米泡溶液。
(2)配制红细胞基础保存液，红细胞基础保存液中各组分浓度：肝素-泊洛沙姆50mg/l、甘氨酸6.0g/l、kh2po40.3g/l、na2hpo4·12h2o10.0g/l、碱性成纤维细胞生长因子10mg/l、甲氧苄啶15mg/l，然后与一氧化氮纳米泡溶液混合，按照表1的设计，调整一氧化氮纳米泡的浓度，规定温度下密封避光放置。
对照组的维持红细胞活性的保存液制备方法参考实验组进行。各个实验组是根据本申请权利要求项保护范围内的组分和比例配置的，而各个对照组是某项组分缺失或组分质量百分含量超出本申请权利要求项保护的范围。
表1实验组和对照组的维持红细胞活性保存液的组成
注：“√”代表该项保存液为实施例1的配方制备；“/”代表该项不存在；no代表一氧化氮气体；o2代表氧气；n2代表氮气。*不同比例的红细胞基础保存液的组成：肝素-泊洛沙姆10mg/l、甘氨酸10.0g/l、kh2po40.3g/l、na2hpo4·12h2o10.0g/l、碱性成纤维细胞生长因子10mg/l、甲氧苄啶15mg/l；#单一组分替换的红细胞基础保存液a：是指肝素-泊洛沙姆被相同浓度的羟乙基淀粉(规格130/0.4)替换的红细胞基础保存液；#单一组分替换的红细胞基础保存液b：是指碱性成纤维细胞生长因子被相同浓度的角质细胞生长因子替换的红细胞基础保存液。
实施例2维持红细胞活性的保存液应用效果
(1)红细胞的制备
将新鲜的o型健康人的红细胞吸出血清后混合，加入2～3倍体积的氧化钠注射液，吹打混匀，置于离心机中3000rpm离心5min，将离心好的o型红细胞试管取出，吸去上清液及附着在红细胞表层的白细胞、血小板等成分，再加入2～3倍体积的氧化钠注射液，混匀后在离心机中3000rpm离心5min，并重复两遍。在第4次离心后，吸出绝大多数上清液，留下压积红细胞。
(2)维持红细胞活性的保存液应用效果
将洗好的红细胞吸出100μl，加入到实施例1制备得到的维持红细胞活性的保存液中(9.9ml/组)，按照表1的放置温度静置6个月，定时轻摇混匀，6个月后取出观察以下指标，评价维持红细胞活性的保存液应用效果。
外观检查：在自然光下以矫正视力目视检查。标准：红细胞悬液静置分层后，上层为保存液，其应清晰透明，无杂质和悬浮物。混匀后为红细胞悬液，其颜色应呈鲜红色，且无红细胞聚集。若红细胞溶血后，游离的血红蛋白释放入保存液中，从而使保存液的颜色变成红色，溶血的程度越严重，保存液的颜色越深。
显微形态：将红细胞悬液混匀后，吸取适量均匀的涂抹到玻片上，在显微镜下观察红细胞的微观形态。标准：正常情况下，红细胞单个散在分布，呈双凹圆盘状。随着保存时间的延长，红细胞的形态发生改变，逐渐变为锯齿状，边缘有很多棘突。在保存后期，红细胞的形态变为球形，很容易发生溶血。
血红蛋白浓度和溶血率：取保存液0.5ml置于试管内，1000g离心5min，分离上清液待用。将hb标准应用液，取0.02ml置于标准管内，取保存液上清液各0.02ml置于测定管内，取蒸馏水0.02ml置于空白管内。于标准管、测定管、空白管内先加入2g/l邻-甲联苯胺溶液1ml，再加入1g/l过氧化氢溶液1ml，充分混匀，放置10分钟。于标准管、测定管、空白管内加入10％醋酸溶液10ml，充分混合，放置10分钟。于分光光度计435nm进行比色，以空白管调零，读取各管吸光度。溶血率计算方式如下：
游离血红蛋白浓度(mg/l)＝[测定管吸光度/标准管吸光度]×标准管的浓度
溶血率＝[游离血红蛋白浓度(mg/l)/3350(mg/l)]×100％
以上实验测定指标结果见表2，综合各个评价指标，给出各组保存液应用效果的总评分。
表2实验组和对照组的应用效果评价
由表2实验结果可见，实验组的红细胞保存液对于静置6个月的红细胞的生存能力和生物学活性保持效果好，特别是实验组4和9，对于红细胞的形态几乎没有影响，游离血红蛋白浓度很低，证明其对于红细胞的生物活性维护的很好。相比实验组，对照组的红细胞保存效果明显较差，特别是对照组1、2、11、12和18，证明缺乏本发明技术保护方案中的任一组分和条件，都会对红细胞的生物活性产生明显的破坏。表2的结果证明，本发明的维持红细胞活性的保存液能明显降低红细胞保存时的溶血率，避免红细胞体外保存时的聚集现象，延长红细胞活性的保存时间，具有良好的应用前景。
上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。