本发明涉及保健食品功效评价
技术领域：
，尤其涉及一种检测保健食品缓解焦虑功效的方法。
背景技术：
：焦虑是包含恐惧、紧张、易怒等感觉的一种精神状态，焦虑症往往体现在认知、躯体、情绪和行为方面的心理和生理状态的异常，并且可能参与多种老年病及慢性病的诱发及恶化，还与抑郁症的发病有很大关系。同时，在焦虑患者中会出现情绪低落，或压抑情绪与躁狂状态交替转换的症状。据who报道，我国具有不同程度心理健康问题的人群高达2-3亿，其中存在约6000多万焦虑症患者。更重要的是，焦虑情绪还与抑郁关系密切，抑郁症中约有35.6％伴发焦虑障碍，最终导致抑郁焦虑共病。抑郁焦虑共病症状重而复杂、病程长、社会功能损害严重。焦虑症、抑郁症是在神经症中发病率较高的两种心理障碍疾病。随着我国进入经济转型期及老龄化快速发展，社会压力增加，焦虑症发病率连年上升，严重影响人们的正常工作和生活。对焦虑症的治疗，除了常规的心理疏导和抗焦虑药物外，对焦虑的形成机制研究及追求理想的治疗手段一直是研究者们关注的焦点。因此，研究焦虑、抑郁等疾病的形成及干预机制具有重要的学术价值及社会效益。近年来的研究表明，双相精神障碍与各种神经递质显著相关。焦虑是一种持久/阶段性的恐惧状态，而持久/阶段性的恐惧均可由大脑杏仁核介导，杏仁核会向下丘脑和脑干输出产生恐惧的症状，释放作用于终纹床核(bednucleusofthestriaterminalis，bnst)受体中的促肾上腺皮质激素释放因子，bnst是边缘系统重要结构之一，是大脑中枢系统情绪情感调节环路中各成员的中继站，并在焦虑症的发病过程中发挥着极为重要的作用。而终纹床核与伏隔核紧密相连，两者均与焦虑症密不可分。ramirezs等发现由“海马体-杏仁核-伏隔核”通道介导的谷氨酸能效应会抑制暴露在慢性压力下的小鼠类似焦虑症行为，该效应还与记忆相关的海马体齿状回细胞的直接激活，减轻焦虑行为相关。在以往焦虑症的研究中，常常选择啮齿类的动物作为研究对象，如大、小鼠。然而，由于神经系统的复杂性、精神类疾病多靶点、多通路的特性，以及个体差异，焦虑和抑郁等精神类疾病的机制及通路并不十分清楚。因此，寻找一种能够大样本、快速、客观评价保健食品缓解焦虑的方法具有重要的研究意义。技术实现要素：本发明为了克服上述现有技术中存在的技术问题，提供了一种大样本、快速、客观准确的检测保健食品缓解焦虑功效的方法。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测保健食品缓解焦虑功效的方法，包括以下步骤：(1)随机选取若干尾斑马鱼，加入待测保健食品和诱导剂，建立试样组；(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的斑马鱼，加入诱导剂，建立斑马鱼焦虑模型组；(3)采用行为分析仪分别测试经过诱导剂处理后的试样组和斑马鱼焦虑模型组内斑马鱼的总运动距离(s)，按照以下公式计算待测保健食品的缓解焦虑功效(％)：用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异，判定待测保健食品具有缓解焦虑功效。近年来的研究表明，双相精神障碍与各种神经递质显著相关。焦虑是一种持久/阶段性的恐惧状态，而持久/阶段性的恐惧均可由大脑杏仁核介导，杏仁核会向下丘脑和脑干输出产生恐惧的症状，释放作用于终纹床核(bednucleusofthestriaterminalis，bnst)受体中的促肾上腺皮质激素释放因子，bnst是边缘系统重要结构之一，是大脑中枢系统情绪情感调节环路中各成员的中继站，并在焦虑症的发病过程中发挥着极为重要的作用。而终纹床核与伏隔核紧密相连，两者均与焦虑症密不可分。ramirezs等发现由“海马体-杏仁核-伏隔核”通道介导的谷氨酸能效应会抑制暴露在慢性压力下的小鼠类似焦虑症行为，该效应还与记忆相关的海马体齿状回细胞的直接激活，减轻焦虑行为相关。5-羟色胺(5-hydroxytryptamine，5-ht)是一种生物活性胺，在哺乳动物中具有不同的作用。在发育过程中，5-ht可作为5-羟色胺能神经元和靶组织的发育信号。在成熟的大脑中，5-ht作为神经递质调节神经元功能，在大脑发育和功能中起到了双重调节作用。最重要的是5-ht存在于各个脑区，其最佳浓度可以通过5-ht合成和代谢的水平来控制。在生物体内，5-ht经过mao的代谢作用，生成5-羟吲哚乙酸(5-hydroxyindole，aceticacid,5-hiaa)。5-ht由氨基酸色氨酸通过中间体5-羟色氨酸(5htp)合成，该合成途径中的限速步骤与色氨酸羟化酶(tph)对色氨酸的作用相关；其代谢水平是由mao介导的氧化脱氨作用开始并促进5-ht代谢生成5-羟吲哚乙酸决定的。生物体内mao表达和5-ht水平的变化会对机体的行为学产生直接影响，故可以通过对斑马鱼行为的变化(斑马鱼总运动距离)来评价保健食品缓解焦虑的功效。行为反应是中枢神经系统最复杂的结局之一。由于斑马鱼容易量化的行为学指标，它们已经成为行为学大脑-神经研究中一个理想的有机体，研究者常常通过环境刺激(新环境)、捕食者的刺激(捕食模型)或嗅觉刺激(报警器信息素)等使斑马鱼由于焦虑产生一系列“非定常行为”，如趋地性(潜水响应)、趋触性(偏好鱼缸边缘/角落)、不动或运动不稳定(突发的疾速游动伴随高速连续转弯)、游动距离减少等，这些非定常行为可用于衡量斑马鱼焦虑的程度。作为优选，检测之前，先将所述斑马鱼于28℃培养箱孵育24h。作为优选，所述诱导剂为1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)。1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)是一种非特异性5-羟色胺(5-ht)能激动剂(主要作用于5ht1a、5ht2c和5ht1d受体)。5-ht广泛存在于与焦虑相关的脑区，如下丘脑、丘脑、基底神经节、边缘系统等，是一种具有双向作用的神经递质。本发明研究发现mcpp激动5htr2a和5ht2c受体使其表达增多，可导致焦虑样行为的增加。作为优选，所述诱导剂的浓度为120～160μm。mcpp浓度为80μm时，斑马鱼总运动距离(5859mm)与正常对照组(5516mm)斑马鱼比较没有统计学意义(p>0.05)；120和160μm浓度时，斑马鱼总运动距离分别为7347和6092mm，与正常对照组斑马鱼比较均具有统计学意义(p<0.001&p<0.05)。说明120和160μm的mcpp均可显著诱导斑马鱼焦虑，且120μm浓度时斑马鱼总运动距离(7347mm)较160μm(6092mm)比较具有统计学意义(p<0.001)。本发明选用mcpp诱导斑马鱼焦虑最佳浓度为120μm。作为优选，步骤(1)和(2)中，所述诱导剂的处理时间为70～90min。诱导剂处理时间为30和50min时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均没有统计学意义(p>0.05)，说明诱导剂处理时间过短，无法建立焦虑模型；70和90min时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均有统计学意义(p<0.05)，说明70～90min是诱导焦虑的最佳时间。作为优选，步骤(3)中，所述行为分析仪灵敏度参数为32。行为分析仪灵敏度参数为22和42时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均没有统计学意义(p>0.05)，根据行为分析仪特性，说明参数22灵敏度太高，无法完全捕捉斑马鱼轨迹，参数42灵敏度太低，过度捕捉如镜面反射的运动轨迹，导致此二个参数均不适用于ab品系斑马鱼行为学检测。行为分析仪灵敏度参数为32时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较有统计学意义(p<0.05)，说明参数为32适用于ab品系斑马鱼行为学检测。作为优选，所述斑马鱼为野生型ab品系斑马鱼。3次生物学重复实验结果显示，al品系斑马鱼总运动距离cv值(45.67％)偏大，且与ab品系(18.00％)比较有统计学意义(p<0.05)，说明ab品系斑马鱼更适用于行为学检测。作为优选，所述斑马鱼为受精后5天的斑马鱼。3次生物学重复实验结果显示，4dpf斑马鱼总运动距离cv值偏大(39.67％)，且与5dpf斑马鱼(19.00％)比较有统计学意义(p<0.05)，说明5dpf斑马鱼更适用于行为学检测。5与6dpf斑马鱼cv值相近(p>0.05)。7dpf斑马鱼总运动距离cv值与5dpf斑马鱼比较没有统计学意义(p>0.05)，但7dpf总运动距离显著下降(p<0.05)，行为不够灵敏。提示5或6dpf斑马鱼均适用于行为学检测，因此，再考虑到饲养成本问题，本发明选用5dpf斑马鱼用于行为学检测实验。因此，本发明具有如下有益效果：本发明以斑马鱼作为检测模型，将斑马鱼容易量化的行为学指标“总运动距离”用于衡量斑马鱼焦虑的程度，以实现快速、客观、大样本检测保健食品缓解焦虑功效。具体实施方式下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。实施例1(1)随机选取28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，分别加入25μg/ml司来吉兰品和120μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理90min，建立试样组；(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼，加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，加入120μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理70min，建立斑马鱼焦虑模型组；(3)采用行为分析仪分别测试经过诱导剂处理后的试样组和斑马鱼焦虑模型组内斑马鱼的总运动距离(s)，行为分析仪灵敏度参数为32，按照以下公式计算待测保健食品的缓解焦虑功效(％)：用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，说明25μg/ml司来吉兰对mcpp诱导的焦虑模型具有缓解作用，判定待测保健食品具有缓解焦虑功效。实施例2(1)随机选取28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，分别加入25μg/ml司来吉兰品和160μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理70min，建立试样组；(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼，加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，加入160μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理70min，建立斑马鱼焦虑模型组；(3)采用行为分析仪分别测试经过诱导剂处理后的试样组和斑马鱼焦虑模型组内斑马鱼的总运动距离(s)，行为分析仪灵敏度参数为32，按照以下公式计算待测保健食品的缓解焦虑功效(％)：用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，说明25μg/ml司来吉兰对mcpp诱导的焦虑模型具有缓解作用，判定待测保健食品具有缓解焦虑功效。实施例3(1)随机选取28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，分别加入25μg/ml司来吉兰品和150μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理80min，建立试样组；(2)随机选取与步骤(1)中数目相同的28℃培养箱孵育24h后的受精后5天的野生型ab品系斑马鱼，加入到六孔板中，每孔(每实验组)30尾，加入150μm1-(3-氯苯基)哌嗪盐酸盐(mcpp)，处理80min，建立斑马鱼焦虑模型组；(3)采用行为分析仪分别测试经过诱导剂处理后的试样组和斑马鱼焦虑模型组内斑马鱼的总运动距离(s)，行为分析仪灵敏度参数为32，按照以下公式计算待测保健食品的缓解焦虑功效(％)：用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，说明25μg/ml司来吉兰对mcpp诱导的焦虑模型具有缓解作用，判定待测保健食品具有缓解焦虑功效。参数确定：1、斑马鱼品系的确定：随机选取4dpf正常野生型ab品系和黑色素等位基因突变型半透明al品系斑马鱼于六孔板中，每孔(每实验组)30尾。ab品系和al品系斑马鱼各设置2个组(即正常对照组和模型对照组，此时均不做任何处理)，每孔容量为3ml。平行设置3次实验。28℃培养箱孵育24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，200μl/尾，1尾/孔，正常对照组不做任何处理，模型对照组均水溶给予mcpp建立斑马鱼焦虑模型。适应20min后，利用行为分析仪检测60min内斑马鱼的总运动距离(s)，以总运动距离的统计学分析结果确定行为学检测最佳用鱼品系。统计学处理结果采用mean±se表示。运动功能改善作用计算公式如下：用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，结果参见表1和表2，p<0.05表明具有显著性差异。表1.实验结果表2.cv值(％)3次生物学重复实验结果如表1和表2显示，al品系斑马鱼总运动距离cv值(45.67％)偏大，且与ab品系(18.00％)比较有统计学意义(p<0.05)，说明ab品系斑马鱼更适用于行为学检测。2、斑马鱼发育阶段的确定：随机选取4、5、6和7dpf的野生型ab品系斑马鱼，每孔(每实验组)30尾，每个发育阶段的斑马鱼均各设置2个组(即正常对照组和模型对照组，此时均不做任何处理)，每孔容量为3ml。平行设置3次实验。组别设置完成后，直接将斑马鱼转移至96孔板中，200μl/尾，1尾/孔，正常对照组不做任何处理，模型对照组均水溶给予mcpp建立斑马鱼焦虑模型。适应20min后，利用行为分析仪检测60min内斑马鱼的总运动距离(s)，以总运动距离的统计学分析结果评价不同发育阶段的斑马鱼模型建立情况及模型的稳定性。统计学处理结果采用mean±se表示。运动功能改善作用计算公式同上。用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，结果参见表3和表4，p<0.05表明具有显著性差异。表3.实验结果表4.cv值(％)3次生物学重复实验结果如表3和表4显示，4dpf斑马鱼总运动距离cv值偏大(39.67％)，且与5dpf斑马鱼(19.00％)比较有统计学意义(p<0.05)，说明5dpf斑马鱼更适用于行为学检测。5与6dpf斑马鱼cv值相近(p>0.05)。7dpf斑马鱼总运动距离cv值与5dpf斑马鱼比较没有统计学意义(p>0.05)，但7dpf总运动距离显著下降(p<0.05)，行为不够灵敏。提示5或6dpf斑马鱼均适用于行为学检测，因此，再考虑到饲养成本问题，建议选用5dpf斑马鱼用于行为学检测实验。3、诱导剂mcpp浓度的确定：随机选取4dpf的野生型ab品系斑马鱼，每孔(每实验组)30尾，设置1个正常对照组和4个模型对照组(此时均不做任何处理)，每孔容量为3ml。28℃培养箱孵育24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，200μl/尾，1尾/孔，正常对照组不做任何处理，模型对照组分别水溶给予mcpp、80、120和160μm建立斑马鱼焦虑模型。适应20min后，利用行为分析仪检测60min内斑马鱼的总运动距离(s)，以总运动距离的统计学分析结果评价斑马鱼模型建立情况，确定诱导剂mcpp最佳诱导浓度。统计学处理结果采用mean±se表示。运动功能改善作用计算公式同上。用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，结果参见表5。p<0.05表明具有显著性差异。表5.实验结果运动距离正常80μm120μm160μm15681.27349.67992.16709.1250727404.46871.1662436822.64015.66855.1594045390.27087.97688.26151.455858.84503.56641.5595665651.46097.97816.96477.775741.55169.46846.46244.584814.84205.86743.95518.195316.54796.87988.85904.7104809.57954.48028.45390.2mean5515.855858.537347.246091.57mean取整数5516585973476092sd592.99383591495.939242597.2247598439.4376964cv11％26％8％7％p0.51370.00000.0249结果如表5显示，mcpp浓度为80μm时，斑马鱼总运动距离(5859mm)与正常对照组(5516mm)斑马鱼比较没有统计学意义(p>0.05)；120和160μm浓度时，斑马鱼总运动距离分别为7347和6092mm，与正常对照组斑马鱼比较均具有统计学意义(p<0.001&p<0.05)。说明120和160μm的mcpp均可显著诱导斑马鱼焦虑，且120μm浓度时斑马鱼总运动距离(7347mm)较160μm(6092mm)比较具有统计学意义(p<0.001)。提示mcpp诱导斑马鱼焦虑最佳浓度为120μm。4、行为分析仪灵敏度参数的确定：随机选取4dpf的野生型ab品系斑马鱼，每孔(每实验组)30尾，设置1个正常对照组、1个模型对照组(此时均不做任何处理)，1个阳性对照组(司来吉兰25μg/ml)。平行设置3次实验。28℃培养箱孵育24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，200μl/尾，1尾/孔，正常对照组不做任何处理，其他实验组均水溶给予mcpp120μm建立斑马鱼焦虑模型。适应20min后，利用行为分析仪检测60min内斑马鱼的总运动距离(s)，第1次实验行为分析仪灵敏度参数设置为22，第2次实验行为分析仪灵敏度参数设置为32，第1次实验行为分析仪灵敏度参数设置为42。以总运动距离的统计学分析结果评价行为分析仪灵敏度参数对模型稳定性的影响，确定最佳灵敏度参数。统计学处理结果采用mean±se表示。运动功能改善作用计算公式同上。用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，结果参见表6。p<0.05表明具有显著性差异。表6.实验结果结果如表6显示，行为分析仪灵敏度参数为22和42时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均没有统计学意义(p>0.05)，根据行为分析仪特性，说明参数22灵敏度太高，无法完全捕捉斑马鱼轨迹，参数42灵敏度太低，过度捕捉如镜面反射的运动轨迹，导致此二个参数均不适用于ab品系斑马鱼行为学检测。行为分析仪灵敏度参数为32时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较有统计学意义(p<0.05)，说明参数为32适用于ab品系斑马鱼行为学检测。阳性对照药司来吉兰在25μg/ml浓度条件下，斑马鱼总运动距离与模型对照组比较有统计学意义(p<0.05)，说明25μg/ml司来吉兰对mcpp诱导的焦虑模型具有缓解作用。造模时间(行为时间)的确定随机选取4dpf的野生型ab品系斑马鱼，每孔(每实验组)30尾，设置1个正常对照组、4个模型对照组(此时均不做任何处理)，1个阳性对照组(司来吉兰25μg/ml)，每孔容量为3ml。平行设置4次实验。28℃培养箱孵育24h后，将斑马鱼转移至96孔板中，200μl/尾，1尾/孔，正常对照组不做任何处理，其余实验组分别水溶给予mcpp120μm，利用行为分析仪分别检测30、50、70和90min内斑马鱼的总运动距离(s)，以总运动距离的统计学分析结果评价斑马鱼模型建立情况，确定诱导剂mcpp最佳处理时间。统计学处理结果采用mean±se表示。运动功能改善作用计算公式同上。用方差分析和dunnett’st-检验进行统计学分析，结果参见表7，p<0.05表明具有显著性差异。表7.实验结果实验结果如表7显示，诱导剂处理时间为30和50min时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均没有统计学意义(p>0.05)，说明诱导剂处理时间过短，无法建立焦虑模型；70和90min时，斑马鱼总运动距离与正常对照组比较均有统计学意义(p<0.05)，说明70-90min是诱导焦虑的最佳时间。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。当前第1页12