半乳糖基转移酶GalT基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途与流程

本发明属于小鼠模型领域，具体涉及一种半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途。技术背景先天性糖基化疾病(cdg)最初被称为碳水化合物缺乏糖蛋白综合症(cdgs)，是一种n-糖基化异常的疾病，临床特征涉及许多器官系统，尤其是大脑某些区域的发育以及胃肠、肝、视觉和免疫系统的功能，几乎所有患者的血清糖蛋白唾液酸化不足。目前关于糖基化疾病的研究多集中于临床病例，但由于病例分型多，样本少导致无法进行广泛系统性研究。定点突变小鼠可批量繁殖，有利于多样本研究。半乳糖基转移酶不仅在细胞运动、胚胎发育、神经系统发育、免疫系统及炎症反应中有重要作用，还在糖蛋白n-糖基化的唾液酸化进程中起到不可或缺的作用。突变半乳糖基转移酶可作为研制先天性糖基化疾病模型小鼠的理论基础。技术实现要素：基于现有技术的状况，本发明目的是提供一种半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途。利用同源重组、随机插入、rnai等技术，应用敲除、定点突变、基因失活等策略对半乳糖基转移酶基因进行改造使其失活。本发明解决其技术问题采用的技术方案是：一种半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法，包括以下步骤：针对小鼠b4galt基因，设计基因敲除策略，敲除区突变域选择；采用基因编辑方法，获得f0代小鼠，将阳性f0代小鼠和c57bl/6j配繁后，得到具有b4galt基因定点突变的阳性f1代杂合子，阳性杂合子小鼠交配后经pcr测序确认获得阳性纯合子。进一步的，一种半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法，包括如下具体步骤：(1)靶点构建：寻找半乳糖基转移酶b4galt基因的cds区，明确外显子部分，确定基因突变位点；(2)获取受精卵，并进行显微注射：通过体外转录的方式，获得cas9mrna和grna，通过合成获得oligodonordna，将cas9mrna、grna和oligodonordna显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠；(3)将阳性f0代小鼠和c57bl/6j配繁后，得到具有b4galt基因定点突变的阳性f1代杂合子；(4)阳性杂合子小鼠交配后经pcr测序确认获得阳性纯合子，表明小鼠模型构建成功。进一步的，为小鼠第4染色体的第4外显子b4galt1基因中的286位氨基酸。更进一步的，所述突变位点是将第286位氨基酸酪氨酸突变为亮氨酸。进一步的，所述grna的dna序列如seqidno:1所示。进一步的，所述oligodonordna的序列如seqidno:2所示。进一步的，所述f0代小鼠的鉴定引物如seqidno:3所示。进一步的，阳性f1代小鼠用于保种建系，不同的保种建系之间原则上不允许交配。本发明还保护上述半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法获得的小鼠模型在糖基化相关疾病的药物中的应用。进一步的，本发明提供了上述小鼠模型在半乳糖基转移酶和糖基化异常疾病诊断和治疗药物中的应用。本发明还保护上述半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法获得的小鼠模型在制备无乳糖乳产品中的应用。本发明保护上述获得半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的试剂盒。进一步的，所述试剂盒含有seqidno:1所示的grna。更进一步的，还含有seqidno:2所示的oligodonordna。本发明还保护所述小鼠模型在半乳糖基转移酶作用研究中的应用。有益效果本发明一种半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法及提供的小鼠模型填补了糖基化机场疾病发病机制研究领域的一项空白，模型制作简单，重复性好，制作成本低廉；其中b4galt1无半乳糖基转移酶活性小鼠模型可用于研究半乳糖基转移酶在哺乳动物中的作用，对研究无乳糖乳产品有一定价值；因此可以在国内外推广应用。附图说明图1a和1b是采用crisp-cas9构建策略示意图；1c是pcr鉴定小鼠基因型的峰谱图；图2为不同基因型小鼠血清中n-链寡糖组的比较。具体实施方式下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。实施例1建议b4galt1-y286基因定点突变小鼠模型一、cas9混样体系1.grna设计如图1构建策略图所示，确定对第4号外显子(exon4)进行基因替换。突变位点上下游序列信息如下：gtcattacttggggtaaaaacttactagccatgggccctctgtctgtgcttcctctccagcctgccatatgttcagtattttggaggtgtctctgctctcagtaaacaacagtttcttgc；oligodonordna序列信息如seqidno:2所示：gtcattacttggggtaaaaacttactagccatgggccctctgtctgtgcttcctctccagcctgccatatgttcagctgtttggaggtgtctctgctctcagtaaacaacagtttcttgc。设计grna序列，所述grna序列如seqidno:1所示：5’-ctgccatatgttcagtattttgg-3’。2.制备cas9混样体系其中所述cas9混样体系为混合物，来源自thermofisher，其包括grna、cas9和缓冲液，浓度分别为cas9蛋白3μg/μl，grna浓度是1μg/μl。二、显微注射及移植制备f0代小鼠的方法包括如下步骤：小鼠的超排；注射受精卵，移植；得到f0代小鼠；其中小鼠品系：c57bl/6j。具体方法如下：(1)挑选实验小鼠：挑选5-6周龄、体重18-22g的小鼠。(2)小鼠超排和注射受精卵：小鼠超排和注射指的是用4周龄的雌鼠，先注射孕马血清促性腺激素(psmg)，来源自solarbio；48小时后注射人绒毛膜促性腺激素(hcg)，来源自solarbio，14小时后取卵，然后体外受精，拿到受精卵；将cas9混样体系混合注射到受精卵中，再移植到假孕母鼠中，得到f0代小鼠。(3)移植：注射完成后，把受精卵移植到假孕母鼠子宫内；移植后的受体2只一笼饲养，术后一周内会持续观察，有疼痛反应的，及时补注射镇痛剂。三、f0代小鼠鉴定及繁育将显微注射出生的f0代小鼠进行pcr和电泳鉴定。pcr扩增引物、pcr反应体系，及程序见下表。扩增引物如下：primersequence5'-->3'primertypeiaggcaggcagatctcaagtcagcforwardiiaaagcccacataggaagccaaagtreversepcr体系如下：pcr程序：步骤温度/℃时间注1945min-29440sec-36340sec-4721min重复2-4步骤，34个循环5721min-612-保存测序引物如seqidno:3所示：5’-aggcaggcagatctcaagtcagc-3’。经过pcr扩增以及电泳鉴定，确定6只f0代鼠为突变杂合子。四、小鼠验证鉴定将阳性杂合子交配后获得后代，剪尾鉴定，得到6只阳性纯合子，分别为14,22,58,65,66,69，具体见下表：编号基因型性别出生日期14ho♀2016/6/1822ho♀2016/7/758ho♀2016/10/2965ho♂2016/12/166ho♂2016/12/169ho♀2016/12/1扩增引物如下：pcr体系：pcr组分来源品牌体积(μl)ddh2o/15.710xlataqpcrbufferthermofisher22.5mmdntpthermofisher0.8primeri(20pmol/μl)金斯瑞0.2primerii(20pmol/μl)金斯瑞0.2taqdna聚合酶thermofisher0.1鼠尾基因组thermofisher1total/20pcr程序：程序温度/℃时间备注1945min-29440s-36340s-4721min重复步骤2-4,34个循环5721min-612-保存测序引物：引物类型序列(5’-3’)测序引物aggcaggcagatctcaagtcagc杂合子小鼠测序结果的“峰形图”为：突变的碱基位点，峰形为双峰；野生型和纯合子小鼠因pcr产物是单一的dna分子，两种基因型的测序结果“峰形图”，在突变位点处均为正常的单峰，但两种基因型的峰图信号不同。因此，在突变碱基位点位点处，出现双峰的为杂合子小鼠；峰形图为正常单峰的，可能是野生型，也可能是纯合子，需根据突变位点的序列信息来判断；参考附图1c。实施例2分析纯合子血清糖基化情况操作方法：(1)血清的前处理将纯合子(ho)小鼠和和野生型(wt)小鼠的血清各50μl从-20℃冰箱中取出，室温融化。(2)n–链寡糖的酶解释放将准备好的血清样品用事先纯化好的n-糖酰胺酶(pngasef)进行消化处理，反应体系如下：加28μl去离子水将血清溶解后，依次加入23μl500mmph7.5磷酸缓冲液，12.5μl变性剂(2％sds水溶液，3％β-巯基乙醇)将其充分混匀后置于金属浴上，95℃加热10min使蛋白变性，然后将样品置于冰上，待其冷却至室温后，加入19μl10％的聚乙二醇辛基苯基醚(triton-100)溶液混匀，与100μlpngasef(1.6mg/ml)在37℃条件下孵育过夜。(3)n–链寡糖的纯化用supelcleantmenvi-carbtm预装柱对反应后的样品进行纯化，首先进行碳柱的活化，依次用3ml80％乙腈(acn)(含0.1％三氟乙酸tfa)，3ml蒸馏水，3ml80％acn(含0.1％tfa)，3ml蒸馏水冲洗碳柱；将反应后的溶液在12100g4℃离心10min，用移液器取上清转移至碳柱中，待其完全流出后，再用3.0ml蒸馏水冲洗柱子，最后分别收集20％acn和40％acn(均含0.1％tfa)洗脱部分(各1.5ml)，将收集好的样品放于真空离心浓缩干燥机旋干。(4)血清n–链寡糖的超高效液相色谱(uplc)检测将旋干后的样品经2ab溶液标记。2ab溶液配制：含35mmol·l-12–氨基苯甲酸胺，0.1mol·l-1氰基硼氢化钠，溶剂为二甲基亚砜(dmso)和冰醋酸(体积比为7:3)。取10μl2ab溶液于旋干后的样品中混匀，65℃金属浴反应4h。经标记处理后的小鼠肝n–链寡糖，加入20μl纯净水，用涡旋振荡仪混匀，12100g离心2min，取上清液15μl与35μl的乙腈混匀，12100g离心3min后取上清液40μl于进样瓶中，进样量为30μl。检测所用色谱柱为behglycancolumn(1.7μm，2.1×150mm，waters)；流动相a为ph4.5的50mmol·l-1甲酸铵溶液；流动相b为色谱纯乙腈；激发波长为330nm；检测波长为420nm；柱温设为60℃。血清结果分析由图2可见小鼠的血清n-聚糖的唾液酸化和半乳糖基化几乎完全消失，该模型小鼠适用于研究糖基化异常疾病。本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。序列表<110>南京农业大学<120>半乳糖基转移酶galt基因点突变小鼠模型的构建方法及其用途<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ctgccatatgttcagtattttgg23<210>2<211>120<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gtcattacttggggtaaaaacttactagccatgggccctctgtctgtgcttcctctccag60cctgccatatgttcagctgtttggaggtgtctctgctctcagtaaacaacagtttcttgc120<210>3<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3aggcaggcagatctcaagtcagc23当前第1页12