一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法与流程

本发明涉及丸组织冻存技术领域，具体地说，是一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，即在生精小管内灌注冻存液后行玻璃化冷冻保存极少量的睾丸组织。

背景技术：

当前，全球范围内育龄人群生育力呈现整体下降趋势，who人类生殖特别规划署报告全球人群不孕不育率至少15％，全球不孕夫妇约6000-8000万对，不孕不育与肿瘤、心血管疾病并列成为当今影响人类健康的三大疾病。据人口协会公布的《中国不孕不育现状调研报告》，我国不孕不育率已高达15％-20％，不孕夫妇约为2000万对。其病因约60％是源自女方因素，而在男性方面，精子总数在50年间下降了一半以上(精子密度≥6000万/毫升降至≥1500万/毫升)，不仅如此，人类精子质量下降问题同样堪忧，无精症发生率约1％。

大部分无精症属于睾丸生精功能损伤引起的非梗阻性无精子症，目前对于无精症的治疗手段主要有内分泌治疗和手术治疗等，其中内分泌治疗能够使约10％的无精症患者自发排精，这部分精子可以直接行卵胞浆内单精子显微注射技术(icsi)或通过稀少精子冷冻技术保存。但是，大部分患者无法通过内分泌治疗自发排精，对于这类患者而言，显微镜下睾丸取精手术是其最后的治疗方案。一些生精功能没有完全丢失的患者的睾丸组织内残存具有完整精子发生的生精小管，这类生精小管在手术显微镜视野下比无精子的生精小管更加粗大和致密，被称之为“生精灶”，通常只存在于睾丸的极少部分区域。手术中将这些生精灶取出后，通过机械剥离和剪碎的方式释放出生精小管内的生精细胞，通过梯度密度离心等方法提纯精子后进行icsi或冻存。

上述手术的方式并没有解决患者生精障碍的根本病因。目前，精原干细胞体外培养扩增并诱导分化成有功能精子是重建noa患者生育力最有前景的治疗方案。体内精子发生依赖于一个复杂的生精微环境，包括各类体细胞构成的生精小管结构和各类信号分析组成的调控网络。目前由于对体内精子发生微环境的了解不充分，使得体外培养体系的效率仍然较低，不足以用于临床治疗。同时，由于“生精灶”不可再生，noa患者的生精障碍通常呈进行性进展，所以需要建立起一套保存手术取得的极少量睾丸生精小管组织的冷冻方法。

目前对于男性睾丸组织/细胞的冻存方法主要有睾丸细胞悬液冻存和睾丸组织慢速降温冻存。前者将睾丸组织通过机械切割和酶消化的方法分离成细胞悬液，破坏了精子发生的空间结构，势必对体外培养产生影响。后者目前主要用于冻存非稀少量的睾丸组织，在冻存过程中容易产生较大型的尖锐的冰晶，同样破坏生精小管结构。近年来发展的组织器官的玻璃化冷冻技术可以减少冰晶的损伤，为了在降温过程中达到玻璃态，需要高浓度的冷冻保护剂和极快的降温速率。生精小管内具有一个相对封闭的管腔，通过直接浸入冷冻保护剂的方式很难使管腔内的液体达到所需浓度，此外，若延长冷冻保护剂的加载时间，则会增加冷冻保护剂对睾丸组织/细胞的渗透损伤。基于这些问题，我们开发了一项首先将冷冻保护剂灌注进生精小管，然后进行玻璃化降温的针对单根生精小管(稀少睾丸组织)的冻存方法，用于保存相关男性患者的生育能力，关于本发明的相关内容目前还未见有相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种基于单根生精小管冻存液灌注后玻璃化降温的冷冻保存方法，用于保存完整的精子发生环境，保存相关男性患者的生育能力。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

首先，本发明提供了一种基于单根生精小管灌注的睾丸组织冻存方法，包括步骤：

(1)将睾丸组织制成单根生精小管；

将单根生精小管置于冻存保护剂1中浸泡10min，所述冻存保护剂1是由以下浓度的组分组成：10％dmso、10％fbs和0.1m蔗糖；

接着将单根生精小管再置于冻存保护2中浸泡1min，同时将冻存保护2灌注到单根生精小管内，所述冻存保护剂2是由以下浓度的组分组成：20％dmso、20％fbs和0.5m蔗糖；

将灌注、浸泡后的单根生精小管迅速转移至cryo-piece单精子冻存薄片上，套入cryo-tubule后直接浸入液氮中进行降温，降温后将单根生精小管先后分别置于复苏液1中浸泡1min、复苏液2中浸泡3min，所述复苏液1是由以下浓度的组分组成：10％fbs和1m蔗糖，所述复苏液2是由以下浓度的组分组成：10％fbs、0.5m蔗糖和df12；

最后转移至常规培养条件下，即可。

优选地，上述步骤(1)具体方法为：利用显微器械将睾丸组织去除间质黏连铺展成单根生精小管，然后将单根生精小管裁剪成长度为≤1cm。

优选地，步骤(3)中是以1ul/s的速度将冻存保护2灌注到单根生精小管内，注射量为1～2ul/cm。

优选地，步骤(4)中复苏液1和复苏液2使用前需要对其预处理加热至37℃。

优选地，步骤(5)中常规培养条件包括：10％fbs的df12培养基。

优选地，所述的睾丸组织来源是生精功能没有完全丢失且残存有能完整发生精子的生精小管的患者。

其次，本发明还提供了一种睾丸组织冻存试剂组合，所述的试剂组合包括：

(1)冻存保护剂1：由10％dmso、10％fbs和0.1m蔗糖组成；和

(2)冻存保护剂2：由20％dmso、20％fbs和0.5m蔗糖组成；和

(3)复苏液1：由10％fbs和1m蔗糖组成；和

(4)复苏液2：由10％fbs、0.5m蔗糖和df12组成。

进一步地，本发明还提供了如上所述的试剂在制备睾丸组织冻存的试剂盒中的应用。

再者，本发明还提供了一种睾丸组织冻存的试剂盒，试剂盒内包括如上所述的试剂组合和该试剂盒的使用说明书，所述该试剂盒的使用说明书包括如上所述的方法。

优选地，所述睾丸组织来源是生精功能没有完全丢失且残存有能完整发生精子的生精小管的患者。

本发明优点在于：

1、相较于传统睾丸细胞悬液冻存，本发明为将来可能的生精细胞培养保留了生精小管的完整结构。

2、相较于传统睾丸组织团块慢速降温冻存，本发明将生精小管分散成单根，能显著减少睾丸组织间隙内大体积锋利冰晶的形成，能更好地避免生精小管的完整性被冰晶破坏(结果可见图3)。

3、本发明通过单根神经小管内灌注冷冻保护剂，避免了睾丸组织在降温前长时间接触高渗溶液，降低了冷冻保护剂的渗透损伤和化学毒性损伤，有效地减少了睾丸细胞的氧化应激水平(结果可见图4)。

4、本发明通过快速降温玻璃化冻存避免了细胞内冰晶的形成，能有效地减少冻存后大量精原干细胞和支持细胞的死亡(结果可见图5)。

5、本发明的方法冻存的生精小管内精子的回收率和活性与目前临床常规使用的麦管玻璃化冷冻方法没有明显差异(结果可见图6)。

综上，本方法优选各步骤、冻存保护剂种类及浓度和最佳冻存保护加载时间、最佳复苏液浓度及方法，可同时较好地保存生精小管结构、维持精子发生重要的体细胞、精原干细胞和成熟精子，为生精功能没有完全丢失的这类患者提供了新的治疗方案，能够实现保存相关男性患者的生育能力的目的。

附图说明

附图1是本发明方法的主要流程图。

附图2是本发明方法中不同配方冻存保护剂的冻存效果比较。

附图3是本发明方法与传统睾丸组织冻存方法中冰晶形成和生精小管比较。

附图4是不同浓度和浸泡时间氧化应激水平比较。

附图5是本发明方法与传统睾丸组织冻存方法的细胞凋亡比较。

附图6是本发明方法与目前常用精子冻存方法的精子参数比较。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1睾丸组织冻存试剂组合

包括：冻存保护剂1：由10％dmso、10％fbs和0.1m蔗糖组成；和冻存保护剂2：由20％dmso、20％fbs和0.5m蔗糖组成；和复苏液1：由10％fbs和1m蔗糖组成；和复苏液2：由10％fbs、0.5m蔗糖和df12组成。

实施例2单根生精小管的冻存保护剂灌注

将于上海市第一人民医院就诊的非梗阻性无精子症患者显微取精术中获取离体的睾丸组织立刻放入至少20倍体积的htf液中运输至实验室。期间将10ul冻存保护剂2吸入icsi用玻璃细针内，连接微流控泵。待样本运至实验室，将样本放入装有htf液的小皿中，在体视镜下使用显微剪和显微镊轻轻将生精小管直接的间质分离，使之成为单根生精小管。使用显微剪将长度超过1cm的生精小管裁剪至1cm。将生精小管转移至装有冻存保护剂1的小皿中，在摇床上浸泡10min。然后将生精小管转移至冻存保护剂2中，并立刻在在体视镜15倍放大视野下将玻璃针内的冻存保护剂2以1ul/s的速度注射进生精小管中，注射总量为每1cm长生精小管注射1～2ul冻存液，生精小管在冻存保护剂2中的加载时间为1min。

实施例3单根生精小管的冻存与复苏

将单根生精小管从冻存保护剂2中拿出，用吸水纸将表面的冻存保护剂轻轻吸干，然后放置于cryo-piece单精子冻存薄片上，套入cryo-tubule后直接浸入液氮中进行快速降温，待温度稳定后在液氮中将冻存样本移至相应储存位置。复苏前，先将复苏液加热至37℃，将生精小管从液氮取出后迅速置于复苏液1(10％fbs+1m蔗糖)中浸泡1min，然后置于复苏液2(10％fbs+0.5m蔗糖+df123min)中浸泡3min，最后转移至合适的培养条件下(例如10％fbs的df12培养基)。

实施例4对照实验

1实验方法

将手术中离体的睾丸组织分成多组，每组分别按照不同的方法冻存，包括正常组、使用低浓度未灌注组、低浓度灌注组、高浓度未灌注组、高浓度灌注组、单根灌注法冻存组、传统慢速法冻存组、低浓度慢速组、高浓度慢速组、低浓度单根组、高浓度单根组、低浓度浸泡5min组、低浓度浸泡15min组、高浓度浸泡5min组、高浓度浸泡15min组、低浓度玻璃化组、低浓度玻璃化灌注组、高浓度玻璃化组、高浓度玻璃化灌注组、熏蒸快速冷冻组、玻璃化灌注组。

实验中所使用的冻存保护剂1：低浓度是指：10％dmso+10％fbs+0.1m蔗糖；高浓度是指：20％dmso+10％fbs+0.1m蔗糖。实验中所使用的冻存保护剂2：低浓度是指：20％dmso+20％fbs+0.5m蔗糖；高浓度是指：40％dmso+20％fbs+0.5m蔗糖。

2实验结果

2.1本方法中不同配方冷冻保护剂的冻存效果比较

见图2，降温过程中组织内冰晶形成的区域折光性较强，显示为深色区域。表明低浓度灌注组相较于传统慢速法冻存组，保留了生精小管的完整结构。

2.2本方法与传统睾丸组织冻存方法中冰晶形成和生精小管比较

见图3，其中a、b图表示不同方法冻存过程中组织间隙冰晶形成；c图表示基于h&e染色统计的管腔完整性；d图表示基于sma蛋白免疫荧光染色统计的管腔完整性。相较于传统睾丸组织团块慢速降温冻存，本发明方法将生精小管分散成单根，能显著减少睾丸组织间隙内大体积锋利冰晶的形成，能更好地避免生精小管的完整性被冰晶破坏。

2.3不同浓度和浸泡时间氧化应激水平比较

见图4，荧光强度为使用细胞氧化应激检测试剂盒检测单根生精小管标准面积内的平均荧光信号，该荧光强度和细胞氧化应激水平呈正比。结果表明低浓度5min组通过单根神经小管内灌注冷冻保护剂，避免了睾丸组织在降温前长时间接触高渗溶液，降低了冷冻保护剂的渗透损伤和化学毒性损伤，有效地减少了睾丸细胞的氧化应激水平。

2.4不同浓度(玻璃化灌注组)与传统睾丸组织冻存方法的细胞凋亡比较

见图5，细胞凋亡采用c-parp抗体标记，生精细胞采用ddx4抗体标记。结果表明，除正常组外，低浓度玻璃化灌注组细胞数量、未凋亡细胞数量最多、凋亡比例最少。其原因归结于低浓度玻璃化灌注组快速降温玻璃化冻存避免了细胞内冰晶的形成，能有效地减少冻存后大量精原干细胞和支持细胞的死亡。

2.5本发明方法与目前常用精子冻存方法(熏蒸快速冷冻组)的精子参数比较

见图6，本发明的方法冻存的生精小管内精子的回收率和活性与目前临床常规使用的麦管玻璃化冷冻方法没有明显差异。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。