一种提高金柚幼果中黄酮类化合物产量的方法与流程

本发明涉及一种提高金柚幼果中黄酮类化合物产量的方法，具体涉及一种通过促进金柚幼果中总黄酮和柚皮苷的合成来提高金柚幼果中黄酮类化合物的产量的方法。

背景技术：

黄酮类化合物是一种重要的天然活性物质，是一种化学多样性的次生代谢物，一般是在植物体内生成的，可以分成下面的几大类：黄酮和二氢黄酮类、查尔酮和二氢查尔酮类、黄酮醇和二氢黄酮醇类、异黄酮和二氢异黄酮类等。黄酮类化合物具有多种生物活性，在医学方面的运用十分广泛。例如，具有心血管系统活性，不少治疗冠心病有效的中成药均含黄酮类化合物；具有：抗菌及抗病毒活性；抗肿瘤活性；抗氧化自由基活性；抗炎、镇痛活性；保肝活性等等；此外，大量研究表明黄酮化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力等活性。

柚皮苷又称柚苷、柑橘苷，是一种天然的黄酮类化合物，化学式为4，5，7-三羟基黄烷酮-7-鼠李糖苷，主要存在于柚子、葡萄柚、酸橙及其变种的果皮中。柚皮苷具有多种药理活性作用，如抗氧化性、抗炎、抗凋亡、降血脂、降血糖、降胆固醇等；此外，在抑制肿瘤的生长、逆转骨质疏松、治疗脑损伤等方面也有一定的疗效。柚皮苷还可以加氢还原制成“柚皮苷二氢查尔酮”，柚皮苷二氢查尔酮是一种无热量的新型甜味剂，可以作为甜味剂应用于各种饮料和日化产品中。目前，每吨柚皮苷市场售价25万元左右，近几年全球柚皮苷的需求量平均以10％至20％的速度增长，市场潜力巨大。

柚子幼果是属芸香科植物酸橙及栽培变种或甜橙的未成熟的果实。柚子具有生理落果阶段和人工疏果阶段，这些阶段都是在柚子幼果时期进行的，所以每年都会产生大量的柚子幼果。因此，对如何充分利用这些幼果进行研究，有利于提高柚子的附加价值和提高经济效益。

研究表明，柚子幼果中含有高达46.83％的柠檬烯及大量的黄酮类化合物，通过提取工艺的优化，疏落柚果中柚皮苷的提取率可达到26.04％，因此，柚子幼果成为了生产柚皮苷的主要原料。对于如何提高黄酮类化合物的产量，目前的研究主要集中在优化黄酮类化合物的提取条件和提取技术上，如乙醇的最佳提取浓度、运用超声辅助乙醇提取、微波辅助乙醇提取等，通过提高黄酮类化合物的提取率来提高其产量，而从促进黄酮类化合物的生成量的角度出发以提高其产量的研究，鲜见报道。

jiajingchen等人通过实验研究，发现柑橘中苦类化合物的代谢规律是不确定的或与环境有关的，而且还发现冷刺激可能会影响葡萄柚果实组织中柚皮苷的生物合成，低温下(霜降温度)，葡萄柚果实组织中柚皮苷的生成量比常温下高(chen,j.,li,s.,xu,j.,etal.(2015).concentrationanddistributionofmainbittercompoundsinfruittissuesof‘oroblanco’(citrusgrandisl.×citrusparadisimacf.).scientiahorticulturae,193,84-89)。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种可以提高金柚幼果中黄酮类化合物产量，特别是提高金柚幼果中总黄酮和/或柚皮苷产量的方法。本发明通过对金柚幼果进行外源性损伤刺激的预处理，可以促进黄酮类化合物的生成，显著提高金柚幼果中黄酮类化合物的含量水平，从而可以显著提高利用金柚幼果提取黄酮类化合物时的产量。

为了实现本发明的目的，采用的技术方案如下：

一种提高金柚幼果中黄酮类化合物产量的方法，包括如下步骤：对金柚幼果进行外源损伤刺激，然后干燥、粉碎，以乙醇为提取溶剂对黄酮类化合物进行提取；其中，黄酮类化合物可以为总黄酮或柚皮苷。

黄酮类化合物是一种抗氧化剂，通过清除自由基和抑制生物膜中脂质过氧化来保护机体免受氧化胁迫。外源性损伤刺激作为一种胁迫刺激，会刺激金柚幼果机体产生自由基，使机体受到过氧化损伤，而为了抵抗机体过氧化，机体会通过多种途径促进抗氧化剂的生成来平衡应激，包括但不限于：(1)苯丙烷代谢途径，所有的黄酮类化合物都来自苯丙烷代谢途径，受到外源性损伤刺激后，金柚幼果中合成总黄酮的关键酶—查尔酮合成酶(chs)和查尔酮异构酶(chi)的基因表达水平提高，从而促进了总黄酮的合成，使得金柚幼果中总黄酮含量水平提高；(2)非酶抗氧化机制，当金柚幼果受到外源性损伤时，机体细胞中的非酶抗氧化剂系统会产生柚皮苷等抗氧化剂来应激外源损伤刺激导致的过氧化毒性，消除外源损伤产生的过多的自由基。因此，对金柚幼果进行外源性损伤刺激的预处理，可以提高黄酮类化合物的生成量，从根源上提高黄酮类化合物的产量。

在一些实施方式中，外源性损伤刺激可以选自碰撞损伤、割伤、挤压、刮伤中的一种或多种。

在一些实施方式中，以乙醇为提取溶剂对总黄酮进行提取的步骤具体可以包括：按料液比1：15-1：30g/ml加入质量分数为70％-85％的乙醇，在温度为50-65℃、超声功率为200-350w的条件下超声提取35-60min，过滤，收集滤液，即得。

在一些实施方式中，以乙醇为提取溶剂对柚皮苷进行提取的步骤具体可以包括：按料液比1：20-1：35g/ml加入质量分数为65％-80％的乙醇，在温度为50-65℃、超声功率为200-350w的条件下超声提取65-80min，过滤，收集滤液，即得。

通过对提取方法的优化，可以提高金柚幼果中总黄酮和柚皮苷的提取率，从而进一步提高总黄酮和柚皮苷的产量。

在一些实施方式中，对金柚幼果进行外源损伤刺激的步骤具体可以包括：对金柚幼果进行碰撞损伤处理，使金柚幼果从离着落点0.8-1.5m的高度自由落下，重复2-15次，对金柚幼果造成碰撞损伤。

在一些实施方式中，可以在对金柚幼果进行碰撞损伤处理后的第2.5-7天对黄酮类化合物进行提取。

在一些实施方式中，对金柚幼果进行外源损伤刺激的步骤具体可以包括：对金柚幼果进行碰撞损伤处理，使金柚幼果从离着落点1m的高度自由落下，重复10次，对金柚幼果造成碰撞损伤。

在一些实施方式中，对金柚幼果进行外源损伤刺激的步骤具体可以包括：对金柚幼果进行割伤损伤处理，用刀对金柚幼果造成刀割损伤，刀割深度为0.5-1.2cm。

在一些实施方式中，可以在对金柚幼果进行割伤损伤处理后的第2.5-5天对黄酮类化合物进行提取。

在一些实施方式中，对金柚幼果进行外源损伤刺激的步骤具体可以包括：对金柚幼果进行割伤损伤处理，用刀在金柚幼果上均匀地切1-8刀，刀割深度为1cm。

对金柚幼果进行外源性损伤刺激时，刺激过大或刺激时间过长，会导致胁迫过度，使得机体自身应激平衡系统崩溃，最终导致黄酮类化合物等抗氧化剂的合成降低，因此，要合理控制外源性损伤刺激的刺激程度和刺激时间。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：提供了一种新的提高金柚幼果中黄酮类化合物产量的方法，从促进金柚幼果中黄酮类化合物的生成量的角度出发，通过给予金柚幼果外源性损伤刺激，促进金柚幼果合成更多的黄酮类化合物，使得金柚幼果中黄酮类化合物的含量水平显著提高，从而可以显著提高金柚幼果中黄酮类化合物的产量。

附图说明

图1为三个处理组总黄酮含量的变化图；

图2为三个处理组柚皮苷含量的变化图；

图3为三个处理组在柚皮苷提取样品原浓度下的红细胞溶血抑制率变化图；

图4为三个处理组在柚皮苷提取样品稀释0.5倍的浓度下的红细胞溶血抑制率变化图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的说明。本发明实施例中，如无特殊说明，所用材料均可以通过常规市售途径获取。

实施例1

(1)取金柚幼果，在模拟碰撞的条件下进行碰撞损伤处理，即，使每个金柚幼果从离着落点约1m的高度自由落下，重复10次，对金柚幼果进行外源性损伤刺激；

(2)进行碰撞损伤处理5天后，取经碰撞损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：20g/ml往金柚幼果粉中加入质量分数为82％的乙醇，60℃、250w超声提取45min，过滤，收集滤液，即得总黄酮提取液，总黄酮提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到总黄酮干粉。

实施例2

(1)取金柚幼果，在模拟碰撞的条件下进行碰撞损伤处理，即，使每个金柚幼果从离着落点约1m的高度自由落下，重复10次，对金柚幼果进行外源性损伤刺激；

(2)进行碰撞损伤处理6天后，取经碰撞损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：28g/ml往金柚幼果粉中加入质量分数为70％的乙醇，60℃、250w超声提取71min，过滤，收集滤液，即得柚皮苷提取液，柚皮苷提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到柚皮苷干粉。

实施例3

(1)取金柚幼果，使每个金柚幼果从离着落点约1m的高度自由落下，重复5次；

(2)进行碰撞损伤处理4天后，取经碰撞损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：30g/ml往金柚幼果粉中加入质量分数为75％的乙醇，60℃、250w超声提取60min，过滤，收集滤液，即得总黄酮提取液，总黄酮提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到总黄酮干粉。

实施例4

(1)取金柚幼果，使每个金柚幼果从离着落点约1m的高度自由落下，重复8次；

(2)进行碰撞损伤处理4天后，取经碰撞损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：20g/ml往金柚幼果粉中加入质量分数为75％的乙醇，60℃、250w超声提取80min，过滤，收集滤液，即得柚皮苷提取液，柚皮苷提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到柚皮苷干粉。

实施例5

(1)取金柚幼果，在模拟割伤的条件下进行割伤损伤处理，即，用刀在每个金柚幼果的果体上均匀地切5刀，控制每刀的深度在1cm左右，对金柚幼果进行外源性损伤刺激；

(2)进行割伤损伤处理3天后，取经割伤损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)以乙醇为提取溶剂对金柚幼果粉中的黄酮类化合进行提取，得黄酮类化合物。

其中，总黄酮和柚皮苷的提取方法参考实施例1。

实施例6

(1)取金柚幼果，用刀在每个金柚幼果的果体上均匀地切3刀，控制每刀的深度在1cm左右；

(2)进行割伤损伤处理2.5天后，取经割伤损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：15g/ml加入质量分数为70％的乙醇，60℃、250w超声提取60min，过滤，收集滤液，即得总黄酮提取液，总黄酮提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到总黄酮干粉。

实施例7

(1)取金柚幼果，用刀在每个金柚幼果的果体上均匀地切8刀，控制每刀的深度在0.5cm左右；

(2)进行割伤损伤处理4天后，取经割伤损伤处理过的金柚幼果进行清洗，切成小块，然后烘干、粉碎，过60目筛，得金柚幼果粉；

(3)按料液比1：35g/ml加入质量分数为80％的乙醇，60℃、250w超声提取65min，过滤，收集滤液，即得柚皮苷提取液，柚皮苷提取液可以进一步通过冷冻干燥等干燥方法得到柚皮苷干粉。

试验例1

1、样品预处理：将大小相近(大约60克/个)、表面无明显腐败现象的柚子幼果分为3组，每组14个果实。对照组(control)不做任何处理；碰撞损伤组(thrown)在模拟碰撞的条件下进行碰撞损伤处理，即幼果从1米高处自由落下，重复10次；刀割损伤组(knife-cutting)在模拟割伤的条件下进行割伤损伤处理，即在每个幼果的果体上均匀地切5刀，控制每刀的深度在1cm左右。随后，将三个处理组样品置于28-30℃的培养箱中观察1-7天。

每天从三个处理组中取2个幼果进行实验。将柚子幼果清洗后切成小块，烘干至恒重，干燥后的样品用多功能粉碎机粉碎，然后过60目的筛网得到幼果干粉，样品干粉储存在干燥箱中以备进一步使用。

2、试验方法：

(1)总黄酮的提取及含量测定

将样品干粉(每个处理组2.0g)用40ml82％乙醇超声提取45min，抽滤，收集滤液即为总黄酮提取液。取1ml滤液于25ml比色管中，加入60％乙醇至6ml，再加入0.75ml5％nano2，静置5min，后加入0.75ml10％al(no3)3，静置5min，然后加入10ml1mol/lnaoh溶液并加入60％乙醇溶液稀释至刻度。充分混匀，后放置10min，取上清液在510nm处测定溶液的吸光度。同时使用标准品芦丁按照同样的实验方法制作标准曲线。得到标准曲线为a＝2.579c-0.0006，r²＝0.9991，其中a代表芦丁标准品的吸光度，c代表浓度。总黄酮含量以每毫升样品溶液当量毫克(mg)表示。

(2)柚皮苷的提取及含量测定

取样品干粉(每个处理组2.0g)按料液比为1g:28ml加入70％的乙醇溶液，充分搅拌均匀后，超声提取71min。抽滤后弃滤渣，得滤液即为柚皮苷提取液。取滤液样品0.1ml于10ml比色皿中，依次加入90％的一缩二乙二醇5ml和4mol/lnaoh0.1ml，加蒸馏水至刻度，摇匀，40℃水浴10min，冷却后，以空白对照作参比，在420nm处检测反应液吸光度，记录并计算样品液浓度。同时使用标准品柚皮苷按照同样的实验方法制作标准曲线。得到标准曲线为a＝10.572c-0.0012，r²＝0.9993，其中a代表柚皮苷标准品的吸光度，c代表浓度。柚皮苷含量以每毫升样品溶液当量毫克(mg)表示。

(3)红细胞溶血抑制率

红细胞的采集来自3名健康成人志愿者的血液样品。严格按照要求获得志愿者的血液样品，使用pbs(ph7.4)对血液样品进行洗涤，每次离心(1200×g，10min，4℃)，重复洗涤3次，离心后得到的红细胞样品立即用4倍体积的pbs(ph7.4)进行稀释，获得红细胞悬浮液。将200μl的红细胞悬浮液加入到200μl柚皮苷提取液中(本实验检测了两个浓度：柚皮苷提取样品原浓度和稀释0.5倍的浓度)，并取等体积的pbs(ph7.4)作为对照组，取等体积的纯水作为100％溶血组。充分混合均匀后，将其在37℃的培养箱中孵育30min，后加入400μl0.2mmaaph，混合均匀后，将其置于37℃的培养箱中孵育2h。完成后，用3.2mlpbs(ph7.4)对所有样品进行稀释处理，然后离心(1200×g，10min，4℃)。离心后，取上清液测定其在540nm处的吸光度。

按照下面公式进行计算：

溶血抑制率(％)＝(1-样品od540/纯水od540)×100

3、试验结果：

(1)总黄酮含量变化

结果如图1所示，在外源性损伤处理后第1-3天，刀割损伤组和碰撞损伤组样品的总黄酮的含量均较对照组有所增加；第3天，刀割损伤组与对照组比较，总黄酮含量有显著差异(p<0.05)；第3-5天，碰撞损伤组与对照组相比，总黄酮含量有显著的升高(p<0.05)；刀割损伤组总黄酮含量在第3天达到最高值，而对照组和碰伤组在第5天最高。在外源性损伤处理第6-7天，三个处理组的总黄酮含量都呈现下降趋势，其中刀割损伤组下降得最为严重。

(2)柚皮苷含量变化

结果如图2所示，在外源性损伤处理后第1-3天，与对照组相比，刀割损伤处理显著增加了幼果中柚皮苷的含量(p<0.05)；而在外源性损伤处理后第3-7天，碰撞损伤处理的柚皮苷含量显著增加(p<0.05)，碰撞损伤处理可以使柚皮苷的含量增加5倍左右。刀割损伤组样品在柚皮苷含量达到峰值后，含量持续降低，而对照组和碰撞损伤组的柚皮苷含量呈现波动上升趋势。

(3)柚皮苷抗氧化能力的变化

aaph诱导的红细胞溶血试验可以直观地揭示其清除自由基的生物学相关能力。因此，可以通过测量柚皮苷溶液的红细胞溶血抑制率来判断柚皮苷的抗氧化能力。结果如图3-4所示。

由图2-4的结果可知，三个处理组的红细胞在两种柚皮苷溶液浓度下的溶血抑制率变化趋势与柚皮苷含量的变化趋势相似，由此可知，外源损伤处理可以改变金柚幼果中柚皮苷的含量，但不对柚皮苷的抗氧化能力造成显著影响。

以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。