一种微生物来源的农用抑菌剂及其制备方法与流程

本发明涉及农业生防领域，具体为一种微生物来源的农用抑菌剂及其制备方法。

背景技术：

植物病原菌能使农作物出现萎蔫、腐烂、斑点、白叶、疫病、枯病等，甚至使植株死亡。植物病原菌不仅威胁农作物产量，还影响农产品的质量安全。由植物病原菌引起的植物病害给农业带来了巨大的经济损失，使得农业病原菌防治具有重要的理论研究和实践应用价值。化学抑菌剂的出现为农业病原菌危害带来了有效防治途径。化学抑菌剂常存在抑菌谱窄、易使植物病原菌产生耐药性等缺陷，同时化学抑菌剂特别是一些有机抑菌剂降解不完全造成在环境中残留。

随着农业发展和科技进步，在农业领域逐渐倾向于研发和应用更加高效、绿色、低毒、低残留的抑菌剂。生物表面活性剂是由微生物合成的具有两亲分子结构的代谢产物，包括糖脂类、脂肽类等，具有抗菌、降低表/界面张力、乳化、渗透等功能。生物表面活性剂对植物病原菌的抑菌谱广，生物表面活性剂还可以增强植株对细菌、真菌的防御能力。利用生物表面活性剂防治农业病原菌病，安全有效、经济环保，并且符合农业防治中预防为主、综合防治的策略原则。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种微生物来源的农用抑菌剂及其制备方法，有利于解决农业病原菌防治中化学抑菌剂抑菌谱窄、易使植物病原菌产生耐药性、降解不完全、易在环境中残留等问题，本发明的农用抑菌剂是微生物来源、抑菌效果好、抑菌谱广，可应用于由植物病原菌引起的农业病害防治。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种微生物来源的农用抑菌剂，抑菌剂活性成分为单鼠李糖脂，其中农用抑菌剂中单鼠李糖脂浓度为0.01wt%~0.5wt%。

所述的农用抑菌剂中单鼠李糖脂浓度为0.02wt%~0.2wt%。

所述的微生物来源的农用抑菌剂为溶液形式，是含单鼠李糖脂的水溶液，或者是单鼠李糖脂产生菌发酵所得含有单鼠李糖脂的发酵培养物、发酵培养悬液或发酵上清液，或者是以上所述液体的稀释液。

所述单鼠李糖脂是由鼠李糖脂混合物中分离获得的单鼠李糖脂，或者是为以单鼠李糖脂产生菌为出发菌株经发酵所得发酵培养物的单鼠李糖脂提取物。

所述微生物来源的农用抑菌剂的制备方法，具体步骤如下：

1）单鼠李糖脂产生菌或者常规鼠李糖脂产生菌的菌种发酵，发酵时间3~6天，发酵温度为30℃~40℃；

2）通过5000~10000g离心处理单鼠李糖脂产生菌的发酵液，除去菌体及不溶物等，获得发酵上清液；或者从常规鼠李糖脂产生菌发酵液中提取单鼠李糖脂和双鼠李糖脂混合物，然后利用薄层色谱法或者制备型hplc等方法分离出单鼠李糖脂组分；

3）根据待制备抑菌剂中单鼠李糖脂浓度，用清水稀释单鼠李糖脂产生菌的发酵上清液；或者用清水和分离的单鼠李糖脂配制单鼠李糖脂溶液。

所述常规鼠李糖脂产生菌是指铜绿假单胞菌或克雷伯氏菌菌属的某些细菌，它们都能产生包含单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的鼠李糖脂混合物。

所述单鼠李糖脂产生菌是常规鼠李糖脂产生菌经基因改造后的菌株，在常规鼠李糖脂产生菌中rhlab基因是单鼠李糖脂合成的关键基因，而rhlc基因是双鼠李糖脂合成的关键基因，将单鼠李糖脂合成的关键基因rhlab导入合适微生物宿主中异源表达构建重组菌，或者敲除常规鼠李糖脂产生菌中的rhlc基因构建敲除菌株，两类基因工程菌都只能表达与单鼠李糖脂合成相关的基因rhlab，使得产生的鼠李糖脂中只是单鼠李糖脂。

所述微生物来源的农用抑菌剂在农业病原菌防治中的应用。

所述抑菌剂能够有效抑制植物病原细菌和病原真菌的生长，且具有广谱的抑菌作用，可用于防治由植物病原菌引起的农业病害。

本发明的有益效果在于：

本发明的农用抑菌剂来源微生物发酵产生的生物表面活性剂，抑菌效果好、抑菌谱广，低毒、生态友好；该农用抑菌剂活性成分为单鼠李糖脂，与双鼠李糖脂相比，单鼠李糖脂的亲水端只含有一个鼠李糖环，因而单鼠李糖脂具有更好的亲脂特性，在与植物病原菌作用时表现出更强溶细胞活性，导致病原菌细胞死亡。因此，本发明的微生物来源农用抑菌剂是一种高效、绿色的植物病原菌抑菌剂，可应用于由植物病原菌引起的农业病害防治。

附图说明

图1为不同鼠李糖脂的抑菌照片。

具体实施方式

结合下述具体实施例对本发明进行详细的说明，使本领域的普通技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。在如下实施例中，如无特殊说明，所用的材料和试剂均可从生化试剂材料公司购买到。

实施例1：常规鼠李糖脂产生菌发酵液中提取、分离单鼠李糖脂组分

常规鼠李糖脂产生菌合成的鼠李糖脂为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的混合物。实施例中以产单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)sg（zhaoetal.comparativestudiesonthestructuralcomposition,surface/interfaceactivityandapplicationpotentialofrhamnolipidsproducedbypseudomonasaeruginosausinghydrophobicorhydrophilicsubstrates.bioresourcetechnology,2020,295,122269）为出发菌株。

lb培养基：蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，补加去离子水至1l，ph7.0。

发酵培养基：甘油45g，nano33.5g，k2hpo4∙3h2o4.0g，kh2po43.0g，mgso4∙7h2o1.0g，加去离子水至1l，ph7.0。

用电子天平分别称量上述试剂，配制相应的培养基；分装后置于121℃下灭菌20min。

待培养基冷却至20℃~40℃后，用接种环刮取菌株sg的菌种斜面，接种到含100mllb培养基的三角瓶中，在37℃、180rpm/min下，培养6-10小时，至od600值为0.6~1.0，得到菌株sg种子液。

然后，以3%的接种量（v/v）将菌株sg种子液接种到发酵培养基中，在37℃、180rpm条件下培养5天，用于发酵生产鼠李糖脂，获得含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的发酵液。

将上述发酵液在8000g条件下离心除去菌体等不溶物，上清液利用氯仿/甲醇（v/v,2:1）萃取其中的鼠李糖脂产物，提取液在50℃下真空旋转蒸发后得到单鼠李糖脂和双鼠李糖脂混合物。

将上述提取到的鼠李糖脂产物进行硅胶柱层析，分离出产物中的单鼠李糖脂，分离方法参照相关文献（钟华.2008.鼠李糖脂的菌体吸附及其对菌体表面的改性作用研究）。

利用薄层色谱法对对分离到的单鼠李糖脂进行验证。取少量分离的单鼠李糖脂溶于二氯甲烷中，制备200mg/l的单鼠李糖脂样品，将样品点在硅胶板上，在氯仿/甲醇/乙酸=65:15:2（v/v/v）的展开剂中展开，用苯酚-硫酸显色剂进行显色，计算其rf值。单鼠李糖脂在薄层硅胶板上只有一个点，其比移值（rf值）为0.85。如果得到的产物是单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的混合物在薄层板上会出现rf值不同的两个点。文献报道单鼠李糖脂的rf值约为0.89、双鼠李糖脂的rf值约为0.55（单鼠李糖脂和双鼠李糖脂薄层色谱分析的相关记载参见，钟华.2008.鼠李糖脂的菌体吸附及其对菌体表面的改性作用研究）。因此，说明从常规鼠李糖脂产生菌发酵液中提取、分离到的鼠李糖脂组分为单鼠李糖脂。

将分离的单鼠李糖脂用水溶解，使浓度达到200~2000mg/l，用作植物病原菌抑菌剂。

实施例2：制备单鼠李糖脂发酵液

选择鼠李糖脂产物为完全是单鼠李糖脂的基因工程菌施氏假单胞菌pseudomonasstutzerirhl（zhaoetal.heterologousproductionofpseudomonasaeruginosarhamnolipidunderanaerobicconditionsformicrobialenhancedoilrecovery.journalofappliedmicrobiology2015,118:379-389）作为生产单鼠李糖脂的出发菌株。

利用实施例1中的lb培养基和发酵培养基，取菌株rhl的斜面1接种环，接种到含100mllb培养基的三角瓶中，在30℃、180rpm/min下，培养6-10小时，至od600值为0.6~1.0，得到菌株rhl种子液。然后，以3%的接种量（v/v）接种发酵培养基在，在37℃、180rpm条件下，培养5天，用于发酵生产单鼠李糖脂，获得单鼠李糖脂发酵液。

将上述获得单鼠李糖脂发酵液用水进行稀释，使单鼠李糖脂浓度达到200~2000mg/l，用作植物病原菌的抑菌剂。

实施例3：从单鼠李糖脂产生菌发酵液中提取单鼠李糖脂

将上述实施例2培养结束的发酵液，在8000g条件下离心除去菌体等不溶物，利用实施例1中的氯仿/甲醇（v/v,2:1）萃取法提取发酵液中的单鼠李糖脂。

利用实施例1中薄层色谱方法定性验证提取到的单鼠李糖脂产物。

利用提取到的单鼠李糖脂制备水溶液，其中单鼠李糖脂浓度为200~2000mg/l，用作植物病原菌的抑菌剂。

实施例4：应用例

利用实施例1~3获得的抑菌剂作用于细菌和真菌，测定抑菌圈大小，评价抑菌效果。

配制lb液体培养基和马铃薯葡萄糖液体培养基，lb琼脂培养基平板和pda培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）平板，分别用于培养细菌和真菌。首先利用液体培养基制备待试细菌和待试真菌的种子液，将种子液稀释10⁵倍后，分别涂布到相应的琼脂平板上；然后在平板上放置直径为10mm的无菌滤纸片，分别在滤纸片上滴加10μl实施例1~3中获得的抑菌剂，单鼠李糖脂浓度均为500mg/l。将平板置于在30℃培养箱培养2天。培养结束后，测量滤纸片周围抑菌圈的大小（mm）。测试菌株为大肠杆菌（ec）、金黄色葡萄球菌（sa）、实验室筛选的尚未鉴定的某植物病原细菌（pa）、某植物病原真菌1（pf1）和某植物病原真菌2（pf2），实验结果如表1所示。

表1：三种抑菌剂的抑菌结果

实施例5：对比例

常规鼠李糖脂产生菌合成的鼠李糖脂产物为单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的混合物。该实施例对比单鼠李糖脂和普通鼠李糖脂（单鼠李糖脂与双鼠李糖脂混合物）的抑菌效果。

以实施例1中的同时产单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的铜绿假单胞菌sg为出发菌株，发酵得到含有单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的发酵液。

利用实施例1中的氯仿/甲醇（v/v,2:1）萃取法提取发酵液中的鼠李糖脂产物（单鼠李糖脂和双鼠李糖脂的混合物）。

利用实施例1中硅胶柱层析方法，分离出其中的单鼠李糖脂组分和双鼠李糖脂组分。

利用蒸馏水溶解分离到的单鼠李糖脂配制成水溶液，使浓度达到500mg/l，用作抑菌剂r1。

利用蒸馏水溶解分离到的双鼠李糖脂配制成水溶液，使浓度达到500mg/l，用作抑菌剂r2。

参照实施例4中的抑菌实验方法，利用抑菌剂r1和抑菌剂r2作用于三种植物病原菌，比较抑菌效果。测试菌株为实验室筛选的尚未鉴定的某植物病原细菌（pa）、某植物病原真菌1（pf1）和某植物病原真菌2（pf2），实验结果如表2所示。

表2：抑菌剂r1和抑菌剂r2的抑菌结果

如附图1所示，测试菌株为实验室筛选的尚未鉴定的某植物病原真菌2，抑菌剂r1为分离到的单鼠李糖脂配制成水溶液，浓度500mg/l，抑菌剂r2为分离到的双鼠李糖脂配制成水溶液，浓度500mg/l。r1和r2抑菌效果可从图中滤纸片周围的抑菌圈大小来比较，r1的抑菌圈大小为32mm，r2的抑菌圈大小为19mm。

本发明的微生物来源的抑菌剂是以单鼠李糖脂为活性成分，抑菌效果好、制备简便、绿色环保，且具有广谱抑菌作用，可应用于由植物病原菌引起的农业病害防治，在农业生防领域具有重要的推广和应用价值。