脂肪组织的冻存与复苏方法及脂肪组织冻存复苏试剂盒与流程

本发明涉及一种脂肪组织的冻存与复苏方法及脂肪组织冻存复苏试剂盒，属于细胞生物学领域。
背景技术：
：自体脂肪移植技术在整形外科领域应用广泛，作为一种理想的移植填充物，脂肪具有来源丰富、取材方便、成本低、无免疫排斥现象等优点，但脂肪移植后存在高吸收率的问题，因此仅进行一次填充手术并不能达到满意的术后效果。虽然近年来众多临床医生和科研人员针对脂肪组织的获取过程、洗涤纯化方法、注射手法等各方面都进行了研究和改良，但移植后的脂肪留存率仍不尽如人意，保持在50％左右的水平。临床使用时需多次抽脂取材和注射填充才能达到预期效果。反复的手术抽脂不仅降低了医生的工作效率，还给患者带来痛苦并且提高并发症发生率。一次获取大量脂肪冷冻保存以备多次治疗，这在节约时间精力成本和减少临床并发症方面具有很大的优势。脂肪间充质干细胞(adiposestemcells，adscs)逐渐成为近年来干细胞储存的重要内容和组织工程及再生医学的研究热点，具有极大的应用潜能，大量研究证实：adscs能够增殖分化形成缺少损伤的细胞，分化结果证实其可被诱导分化成多种细胞，包括脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞和神经细胞等。有研究证明，利用脂肪组织中提取的脂肪间充质干细胞和脂肪组织混合移植的方式可以有效的提高脂肪组织的成活率，达到更好的整形效果。为避免多次手术抽脂取材、实现“一次获取，多次治疗”的目的，探索一种体外长期保存自体脂肪组织的方法显得尤为重要。深低温冻存是储存人体组织、细胞最常用方法，且可利用冻存的脂肪组织提取脂肪间充质干细胞，此方法具有取材容易、不用二次取材、储备量大、体外可大规模培养等优点。目前脂肪组织的低温保存方法未形成统一的标准化方案，提取的脂肪组织不进行处理单纯进行冻存会出现脂肪组织坏死、提取的间充质干细胞数量不足、活性不强的缺点，且冻存脂肪的生物学活性和临床应用的安全性一直未得到证实，如何将大量获取的脂肪组织进行保存且保持细胞活性是目前迫切需要解决的实际问题。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明提供了一种脂肪组织的冻存方法、复苏方法，提供了一种脂肪组织冻存液、复苏液，提供了一种脂肪组织冻存、复苏试剂盒。本发明建立了完善的样本采集规范，建立了标准的脂肪组织冻存工艺，同时建立了细胞复苏培养工艺，形成了一套完整的脂肪组织冻存复苏试剂盒，利用该试剂盒处理的脂肪组织经超低温冷冻可长期保存，脂肪组织复苏后提取的脂肪间充质干细胞可保持干细胞相关特性。本发明是通过以下技术方案实现的：一种脂肪组织的冻存方法，包括以下步骤：(1)脂肪组织的预处理：取采集的脂肪标本，离心去掉上层油脂，下层水层，保留中层脂肪组织，中层脂肪组织用生理盐水洗涤1～3次，得到洗涤后的脂肪组织；(2)向上述脂肪组织中加入脂肪组织冻存一阶段试剂，离心洗涤；离心后去除洗涤液，向剩余的脂肪组织中加入脂肪组织冻存二阶段试剂，混匀，4℃下预冷15min，然后转移至程序降温仪中进行程序降温；程序降温结束后，将冻存的脂肪细胞转移至-196℃的液氮存储罐中存储；所述程序降温程序为：4℃保持5min，5℃/min降温到0℃；0℃保持5min，2℃/min降温到-15℃；-15℃保持5min，1℃/min降温到-65℃；-65℃保持5min，0.5℃/min降温到-80℃。所述脂肪组织冻存一阶段试剂，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基75％～80％，二甲基亚砜(dmso)5％～15％，海藻糖5％～8％。所述脂肪组织冻存二阶段试剂，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基75％～80％，二甲基亚砜(dmso)5％～15％，海藻糖3％～8％，丙二醇2％～4％，谷胱甘肽0.5％～1％，丙酮酸钠0.08％～0.12％。所述步骤(1)中，所述脂肪标本，是从被采集者(性别不限，年龄优选35岁以下)的大腿部、脐下腹部采集的皮下脂肪，这些部位的脂肪组织含量丰富，且脂肪颗粒细腻均匀纯净；采集时，被采集者俯卧固定于手术台上，常规消毒铺单，用抽脂针等抽脂设备按需求抽取皮下脂肪，采集的脂肪样本体积为100～200ml，样本为单人样本，不可为混合样本；采集后，立即置于无菌采集袋中(避免长时间暴露在外部环境中导致污染)，4℃保存，备用。进一步的，所述被采集者的hbsag、anti-hcv-igg、anti-hivi/ii-igg、anti-cmv-igm、tp、elisa、ebv等的检测结果合格。进一步的，所述脂肪标本的具体采集方法为：按术前设计划线后常规消毒铺巾配制肿胀液林格氏液100ml+2％利多卡因注射液30ml+肾上腺素注射液1ml；患者预吸脂供区肿胀麻醉成功后，使用侧孔直径1mm、针管直径3mm的多侧孔吸脂针，连接20ml注射器进行吸脂；吸脂前注射器先回抽10ml(此时注射器内负压值约为-60kpa)；低负压吸脂较高负压吸脂获取的脂肪细胞数量多、活性好，获得的脂肪抽吸物置于无菌注射器中，低温环境下迅速转移至实验室。进一步的，所述步骤(1)的具体操作方式为：取采集的脂肪标本，分装转移至50ml离心管中，离心(800g，8min)；吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，加入等体积的生理盐水，离心(800g，8min)，弃掉上清；重复生理盐水洗涤脂肪组织两次。进一步的，所述步骤(1)是在生物安全柜中进行操作的，分装转移前打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯，实验耗材同时照射30min，然后进行后续操作。进一步的，所述步骤(2)中，脂肪组织与脂肪组织冻存一阶段试剂的体积比为1:1。进一步的，所述步骤(2)中，脂肪组织与脂肪组织冻存二阶段试剂的体积比为1:1。进一步的，所述步骤(2)的具体操作方式为：向上述脂肪组织中加入等体积的脂肪组织冻存一阶段试剂，离心(1500rpm，5min)洗涤；离心后去除洗涤液，剩余的脂肪组织用玻璃棒进行搅匀，分装到5ml冻存管中，每管2.5ml，加入脂肪组织冻存二阶段试剂，放入漩涡振荡器混匀，转移至4℃冰箱内预冷15min，然后转移至程序降温仪中进行程序降温。一种冻存的脂肪组织的复苏方法：从液氮中取出利用上述冻存方法冻存的脂肪组织，融化；向融化后的液体中加入脂肪组织复苏液，离心洗涤；离心后去除洗涤液，完成复苏，脂肪沉淀可进行原代培养。所述脂肪组织复苏液，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基75％～85％，右旋糖苷15～25％，l-谷氨酰胺1％～2％，d-葡萄糖1％～2％。进一步的，脂肪组织的复苏是在生物安全柜中进行的，操作前打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯，实验耗材同时照射30min，然后进行后续操作。进一步的，所述复苏方法具体为：从液氮中取出利用冻存的脂肪组织，置于37℃水浴锅(事先预热至37℃)中融化；向融化后(约1min后)的液体中加入脂肪组织复苏试剂，离心洗涤(1500rpm，5min)；离心后去除洗涤液，得脂肪沉淀。进一步的，进行原代培养的方法为：向脂肪沉淀中加入等体积的消化液和等体积的ⅰ型胶原酶溶液(浓度为0.2％)，充分混匀封口后放入37℃摇床，150转/min，消化1小时；消化后，离心(800g，10分钟)，弃掉上层脂肪，用dmem/f12培养基(dmem培养基与f12培养基按1:1的体积比混合而成)重悬细胞沉淀，离心(800g，10分钟)；弃掉上清，用dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，用100μm的筛网过滤得脂肪细胞，离心(800g，10分钟)，弃上清，将脂肪细胞用完全培养基重悬，接种至培养瓶中，保证接种细胞浓度为2.5×104cells/ml，放入37℃、co2培养箱中进行培养，24小时后细胞换液，去除未贴壁细胞；以后每三天换液一次。培养至第五天左右，细胞生长密度达到90％左右，可用于传代培养。一种脂肪组织的冻存复苏试剂盒，包括上述的脂肪组织冻存一阶段试剂，脂肪组织冻存二阶段试剂，脂肪组织复苏液。进一步的，规格为：脂肪组织冻存一阶段试剂一瓶，500ml/瓶；脂肪组织冻存二阶段试剂一瓶，200ml/瓶；脂肪组织复苏液一瓶，200ml/瓶；实际应用时，根据实验需要进行取用，理论上一套该冻存试剂盒可用于500ml脂肪组织的冻存。本发明的技术方案，汇总形成一种以冻存脂肪组织方式保存干细胞的冻存、复苏试剂盒，主要包括：利用脂肪组织冻存液对脂肪组织进行冻存，利用冻存后的脂肪组织进行复苏，可制备提取间充质干细胞，培养出的细胞扩增效率高，细胞形态正常，流式鉴定结果符合脂肪间充质干细胞相关特性。脂肪组织冻存复苏后，观察冻存复苏后提取的脂肪间充质干细胞的细胞提取效率和提取后间充质干细胞的增殖分化能力和干细胞标志物的表达。所获得的脂肪干细胞贴壁生长，脂肪间充质干细胞5代内可以稳定传代增殖，细胞代次间倍增时间约为3天，表达cd29、cd44、cd105等脂肪干细胞标志物，不表达cd34、cd45、hla-dr。利用本发明的冻存方法进行脂肪组织的冻存，可批次冻存大量的脂肪组织，高效的进行脂肪组织资源的利用，且冻存时无需进行脂肪组织的消化、接种、培养等工序，节省大量时间和经济成本。冻存的脂肪组织可长时间、大量的保存。需要时将冻存的脂肪组织进行复苏、消化，获得所需的细胞，经实验验证，该方法冻存的脂肪组织可保持长时间细胞活性，复苏后提取的脂肪干细胞，经鉴定说明，能表达多种干细胞标志物，可向脂肪、骨、软骨细胞进行分化，具有非常好的稳定性，极大的提升了脂肪组织的利用率。本发明具有以下有益效果：本发明确认了一种脂肪组织冻存、复苏试剂盒，可将人体内抽取的新鲜脂肪组织进行深低温冻存，保证脂肪组织活性，冻存的脂肪组织复苏后可从中稳定的提取脂肪间充质干细胞，脂肪间充质干细胞可高效表达表达cd29、cd44、cd105等脂肪干细胞标志物，不表达cd34、cd45、hla-dr。利用此冻存方法可批次的进行大量的脂肪组织冻存，长期保持冻存的脂肪组织活性，脂肪使用时只需进行脂肪组织冻存复苏、提取，不需进行人体脂肪多次抽取，减轻患者痛苦。脂肪组织冻存前进行样本处理，除去脂肪组织中多余的肿胀液，粗大结缔组织和血液混合物，离心去除多余的透明油脂，最终保留中层的脂肪组织颗粒进行下步实验，提高脂肪组织利用效率。脂肪组织冻存前用脂肪组织冻存一阶段试剂进行脂肪组织润洗，稀释清洗掉脂肪组织中多余的水分，减少冻存时细胞内外冰晶的形成，减轻冻存时对细胞的损伤，再用脂肪组织冻存二阶段试剂进行冻存，提高细胞活率。本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。附图说明图1：本发明的脂肪组织的冻存方法、复苏方法的工艺流程图。图2：冻存脂肪复苏消化接种培养7天后的脂肪间充质干细胞(100×)。图3：p02代脂肪间充质干细胞(100×)。图4：流式细胞仪检测结果示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。本发明所用各种液体说明如下：脂肪间充质干细胞完全培养基：采购的商品化的脂肪间充质干细胞培养基，本文中提到的脂肪间充质干细胞培养基采购自北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，货号:16070007。脂肪组织消化液：由ⅰ型胶原酶、胰酶和dmem/f12组成。其中，胶原酶浓度为0.1-0.3g/100ml例如0.120g/100ml，胰酶浓度为0.125-0.25％。脂肪干细胞消化液：由胰蛋白酶组成，其中胰蛋白酶的浓度0.25-0.3g/100ml,例如0.27g/100ml。脂肪间充质干细胞培养基，是脂肪间充质干细胞常用的培养基，可购自商业公司，本文中提到的脂肪间充质干细胞培养基采购自北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司，货号:16070007。胶原酶是水解结缔组织中胶原蛋白成分的一种试剂，可购自商业公司，本文中使用的胶原酶是采购自sigma公司的ⅰ型胶原酶，货号:c0130,dmem/f12是细胞培养中常用的基础培养基，本文使用的dmem/f12采购自gibco公司，货号：c11330500bt。pbs是细胞培养中常见的试剂，pbs采购自hyclone公司，货号：sh30256.01。右旋糖苷为血容量扩充药，有提高血浆胶体渗透压、增加血浆容量和维持血压的作用，是一种血浆的替代物，常用在体外代替血浆。dmso是一种渗透性保护剂，能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性,本文使用的dmso采购自wak，货号：wak-dmso-70。dmem是一种实验室常见的基础培养基，本文使用的dmem为hyclone公司生产的，货号sh30022.01。dmem/f12是实验室常见的基础培养基，本文使用的dmem/f12为hyclone公司生产的,货号：sh30023.01b。l-谷氨酰胺是细胞培养中常用试剂，分解后产生的谷氨酸是细胞生长必备的营养物质、l-谷氨酰胺采购自gibco公司，货号：sh30034.01。本发明所用各种耗材说明如下：10ml移液管、50ml离心管均采购自corning公司，10ml移液管货号为4488，50ml离心管货号为430828。实施例1脂肪组织的冻存、复苏脂肪组织的冻存方法，步骤如下：(1)脂肪组织的预处理：①脂肪样本采集要求：被采集者病毒检测：(hbsag)、(anti-hcv-igg)、(anti-hivi/ii-igg)、(anti-cmv-igm)、(tp、elisa)、(ebv)检测结果合格；②样本采集方法：按术前设计划线后常规消毒铺巾配制肿胀液林格氏液100ml+2％利多卡因注射液30ml+肾上腺素注射液1ml；患者预吸脂供区肿胀麻醉成功后，使用侧孔直径1mm、针管直径3mm的多侧孔吸脂针，连接20ml注射器进行吸脂；吸脂前注射器先回抽10ml(此时注射器内负压值约为-60kpa)；低负压吸脂较高负压吸脂，获取的脂肪细胞数量多、活性好，获得的脂肪抽吸物置于无菌注射器中，低温环境下迅速转移至实验室；③脂肪组织处理：通过吸脂手术抽取的脂肪标本，低温保存(4℃冰盒)，22h内运至实验室；打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯，实验耗材同时照射30min；将脂肪组织转移至50ml离心管中，800g，8min进行离心；离心后的脂肪组织，吸掉上层油脂，将中层脂肪组织转移至新的离心管中，加入等体积的生理盐水，离心(800g，8min)，弃掉上清；重复生理盐水洗涤脂肪组织两次。(2)向上述脂肪组织中加入等体积的脂肪组织冻存一阶段试剂，离心(1500rpm，5min)洗涤；离心后去除洗涤液，剩余的脂肪组织用玻璃棒进行搅匀，分装到5ml冻存管中，每管2.5ml，加入脂肪组织冻存二阶段试剂，放入漩涡振荡器混匀，转移至4℃冰箱内预冷15min，然后转移至程序降温仪中进行程序降温；程序降温结束后，将冻存的脂肪细胞转移至-196℃的液氮存储罐中存储；所述程序降温程序为：4℃保持5min，5℃/min降温到0℃；0℃保持5min，2℃/min降温到-15℃；-15℃保持5min，1℃/min降温到-65℃；-65℃保持5min，0.5℃/min降温到-80℃。所述脂肪组织冻存一阶段试剂，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基78％，二甲基亚砜(dmso)15％，海藻糖7％。所述脂肪组织冻存二阶段试剂，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基78％，二甲基亚砜(dmso)12％，海藻糖6.1％，丙二醇3％，谷胱甘肽0.8％，丙酮酸钠0.1％。上述冻存的脂肪组织的复苏方法：打开层流，打开生物安全柜的紫外线灯照射30min；从液氮中取出利用冻存的脂肪组织，置于37℃水浴锅(事先预热至37℃)中融化；向融化后(约1min后)的液体中加入脂肪组织复苏试剂，离心洗涤(1500rpm，5min)；离心后去除洗涤液，得脂肪沉淀，脂肪沉淀进行原代培养。所述脂肪组织复苏液，是由以下组分组成的，各组分按重量百分比计：dmem培养基78％，右旋糖苷19％，l-谷氨酰胺1.5％，d-葡萄糖1.5％。进行原代培养的方法为：向脂肪沉淀中加入等体积的消化液和等体积的ⅰ型胶原酶溶液(浓度为0.2％)，充分混匀封口后放入37℃摇床，150转/min，消化1小时；消化后，离心(800g，10分钟)，弃掉上层脂肪，用dmem/f12培养基(dmem培养基与f12培养基按1:1的体积比混合而成)重悬细胞沉淀，离心(800g，10分钟)；弃掉上清，用dmem/f12培养基重悬细胞沉淀，用100μm的筛网过滤得脂肪细胞，离心(800g，10分钟)，弃上清，将脂肪细胞用完全培养基重悬，接种至培养瓶中，保证接种细胞浓度为2.5×104cells/ml，放入37℃、co2培养箱中进行培养，24小时后细胞换液，去除未贴壁细胞；以后每三天换液一次。培养至第五天左右，细胞生长密度达到90％左右，用于传代培养。一种脂肪组织的冻存复苏试剂盒，包括上述的脂肪组织冻存一阶段试剂，脂肪组织冻存二阶段试剂，脂肪组织复苏液，规格为：脂肪组织冻存一阶段试剂一瓶，500ml/瓶；脂肪组织冻存二阶段试剂一瓶，200ml/瓶；脂肪组织复苏液一瓶，200ml/瓶；实际应用时，根据实验需要进行取用，理论上一套该冻存试剂盒可用于500ml脂肪组织的冻存。实验1按实施例1的冻存方法进行组织冻存，经验证，脂肪组织冻存6个月内脂肪组织内提取的脂肪间充质干细胞呈纤维样形态，大小均一、排列紧密，呈漩涡状生长，如图2、图3所示。流式细胞仪检测结果显示，脂肪组织冻存复苏后消化产生的细胞，表面标记物cd29、cd44；cd105呈阳性表达(>99％)，细胞表面标记物cd34、cd45、hla-dr呈阴性表达(<2％)，如图4所示。实验2按实施例1的冻存方法进行组织冻存，同时以常规的冻存方法为对照。结果如表1、表2所示。脂肪组织常规冻存方法为：进行脂肪组织离心后分离油脂成分和油水混合物，直接进行脂肪组织冻存，保存于-80℃冰箱中进行存储。从各项检测结果中观测到，随着冻存时间的延长，脂肪组织的颗粒和生物学活性逐渐下降，在冻存早期一周，四周，镜下观察脂肪组织结果变化的不明显。利用本发明的方法进行脂肪组织冻存，在冻存4周、8周、12周时对脂肪进行复苏提取，冻存12周后，细胞数量仍然较多，细胞活性较高，均明显优于常规的冻存方法。表1直接冻存冻存时间冻存0周冻存1周冻存12周提取细胞数量2.5±0.2*1060.34±0.1*1060.28±0.1*106提取细胞活性98.20％50.50％34.10％表2利用本发明的方法进行冻存给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。当前第1页12