一种防治植物病害的复合抗菌药剂的制作方法

本发明属于农药杀菌剂领域，具体涉及一种防治植物病害的复合抗菌药剂及其制备方法与应用。

背景技术：

植物细菌性病害严重影响农产品的产量与质量，造成了严重的经济损失。如由细菌病原体黄单胞杆菌属（xanthomonascitrisubsp.citri(xcc)）引起的柑橘溃疡病是柑橘产业常见的细菌性病害，会造成树叶与果实的掉落，在全球范围内影响着柑橘产业的经济价值；黄龙病是韧皮杆菌属的革兰氏阴性菌，不仅使叶片转黄，还会使产品与品质下降，严重时造成整片林园被毁；还有其他如水稻白叶枯病、猕猴桃溃疡病、烟草青枯病等植物病害，严重影响人类经济效益。

在植物病害防治过程中，化学农药如噻菌铜、叶枯唑、硫酸链霉素等药物是防治病害的主要手段。但大量使用化学农药不仅会造成病菌产生抗性，而且会造成药物的高残留。随着人们生活的提高，人们对于人体健康、食品安全、环境安全的诉求越来越强烈，因此，传统的化学药剂已不能满足现代农业的植物病虫害防控的需求，开发高效、安全低毒、环境友好的新型农药有着重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有农药杀菌技术的不足，将光敏剂药剂引入到农业抗菌领域中，提供一种低毒、高效的植物病害防治用复合抗菌药剂。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种防治植物病害的复合抗菌药剂，其是由组分a和组分b按一定重量比例混合制得；其中，组分a的重量占比为10-50%，组分b的重量占比为50-90%，两者之和为100%；优选地，组分a的重量占比为20%，组分b的重量占比为80%；

所述组分a为2,6-二x-1,3,5,7-四甲基-8-(对-苯甲酸)-4,4′-二氟二氮杂达烯（2,6-x-1,3,5,7-tetramethyl-8-(p-benzoicacid)-4,4′-difluoro-bora-dia-zain-dacene），其化学结构式为：

，其中x为br或i，可参照文献“highlyefficientenergytransferinthelightharvestingsystemcomposedofthreekindsofboron-dipyrromethenederivatives”或“porousmaterial-immobilizediodo-bodipyasanefficientphotocatalystforphotoredoxcatalyticorganicreactiontopreparepyrrolo[2,1-a]isoquinoline”进行制备；

所述组分b为五聚赖氨酸酞菁锌（pentalysineβ-carboxylphthalocyaninezinc），其化学结构式为：

，可参照文献“pentalysineβ-carbonylphthalocyaninezinc:aneffectivetumor-targetingphotosensitizerforphotodynamictherapy”进行制备。

以组分a与组分b为原料制备的复合抗菌药剂可用于植物真菌或细菌病害的防治，尤其适用于柑橘溃疡病菌的防治，其应用方法是将所述复合抗菌药剂用水稀释至45~120μg/ml后喷洒在叶面上，然后以太阳光为光源进行防治。同时，组分a与组分b也可独立作为杀菌剂，但其复合抗菌效果远超单一药剂的使用。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

本发明复合药剂制备简单，原料易得，反应条件温和，适合推广应用，且其具有抗菌谱广泛、对植物本身低毒、对细菌高效、与环境友好的特点，对于减少药物在环境中的积累以及减弱病原微生物的耐药性有着积极作用，克服了普通活性杀菌剂高残留、高污染、易产生抗性等缺陷。

附图说明

图1为实施例1所用组分a的氢谱。

图2为实施例1所用组分b的氢谱。

图3为光照条件下复合抗菌药剂对柑橘溃疡菌的抗菌效果。

图4为本发明复合抗菌药剂防治植物感染的实验结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进行详细阐述，下述实施例并不是对本发明保护范围的限制，任何在本发明基础上做出的改进和变化都在本发明的保护范围之内。

作为组分a的2,6-二碘-1,3,5,7-四甲基-8-(对-苯甲酸)-4,4′-二氟二氮杂达烯参照文献“highlyefficientenergytransferinthelightharvestingsystemcomposedofthreekindsofboron-dipyrromethenederivatives”或“porousmaterial-immobilizediodo-bodipyasanefficientphotocatalystforphotoredoxcatalyticorganicreactiontopreparepyrrolo[2,1-a]isoquinoline”进行制备，其制备步骤具体为：将4-羧基苯甲醛（0.52g，3.47mmol）、2,4-二甲基吡咯（0.63g，6.63mmol）与两滴三氟乙酸一起加入装有500ml无水二氯甲烷的圆底烧瓶中，在氮气保护下避光搅拌反应过夜，然后将溶解于无水二氯甲烷中的2,3-二氯-5,6-二氰基对苯醌（ddq，0.62g，2.74mmol）加入到反应瓶中，避光继续搅拌4h。在冰水浴下，用恒压低液漏斗依次将三乙胺（18ml，0.13mol），bf3·et2o（18ml，0.15mol）滴加到混合液中，室温搅拌过夜。经薄层色谱法（tlc）监测反应。反应完成后，首先将混合物用饱和nahco3水溶液洗涤，然后在二氯甲烷萃取三次，收集有机相经无水na2so4干燥，经浓缩后在真空下干燥。粗产物通过硅胶柱色谱法纯化，使用ch2cl2/石油醚（1∶2，v/v）作为洗脱剂，得到化学物2的橙黄色固体（0.40g，产率39％，结构式）。接下来，将i2（0.31g，1.21mmol）和hio4（0.17g，0.98mmol）添加至化合物2（0.19g，0.53mmol）的无水乙醇（200ml）溶液中，然后在氮气保护条件下，60℃避光搅拌6小时。反应完成后，通过薄层色谱法（tlc）监测，将混合物减压旋蒸除去无水乙醇，然后以ch2cl2/石油醚（1：3，v/v）作为洗脱剂，经硅胶柱纯化得到目标产物的红色固体（0.25g，产率85％，结构式），其表征数据为：¹h-nmr(brukerav-400,400mhz,cdcl3):δ=8.27(d,j=8.0hz,2h,arh)，δ=7.43(d,j=8.0hz,2h,arh)，δ=2.66(s,6h,ch3),1.39(s,6h,ch3)。

作为组分b的五聚赖氨酸酞菁锌参照文献“pentalysineb-carbonylphthalocyaninezinc:aneffectivetumor-targetingphotosensitizerforphotodynamictherapy”进行制备，其表征数据为：¹h-nmr(brukerav-400,400mhz,[d6]dmso):d=9.699(s,1h)，7.816-9.311(m,30h)，4.027-4.902(m,5h)，2.787-2.926(m,10h)，1.078-2.122ppm(m,30h)。

实施例1：制备复合抗菌药剂

将组分a与组分b按重量比1:4混合均匀，然后用少量dmso溶解，作为储备液。

实施例2：复合抗菌药剂对柑橘溃疡病菌的抗菌性能

实验菌株：柑橘溃疡病菌。

实验操作步骤如下：

（1）将实施例1制备的复合抗菌药剂储备液用pbs溶液稀释至终浓度为330、100、33、10、3.3、1、0.33、0.1、0.033μm，然后用移液枪分别移取各浓度药物20μl，加入96孔透明板中。以相同体积的pbs溶液作为空白对照。

（2）吸取200μl菌液（10⁶cfu/ml）加入到各加药孔中，太阳光模拟器（波长295-2500nm、功率80mw/cm²）照射1min，光剂量为4.8j/cm²，随后使用无菌pbs分别将各组稀释成不同浓度梯度，稀释梯度为10×、100×、1000×和10000×，100000×，取100μl涂抹于预先配置好的细菌培养板中，培养48h后，做活菌落计数。

（3）试验重复3次，按下式计算抑菌率：

x＝(a–b)/a×100%；

式中：x-抑菌率（％）；a-对照样品平均菌落数；b-被试样品平均菌落数。

图3为光照条件下复合抗菌药剂对柑橘溃疡菌的抗菌效果。如图3所示，在光照条件下，复合药剂对柑橘溃疡病菌的ic50为微摩尔数量级，表现出极佳的抗菌效果。

实施例3：复合抗菌药剂最小抑菌浓度

（1）将浓度为744μg/ml的复合抗菌药剂用nb培养基液稀释至终浓度为372、186、93、46.5、23.3、11.7、5.7、2.91、1.44、0.72、0.36μg/ml。将100μl、4000μg/ml的硫酸铜或氢氧化铜储备液用新鲜的nb培养基依次稀释至2000、1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9和1.96μg/ml的浓度为阳性对照。以相同体积的pbs溶液作为空白对照。用移液枪分别吸取浓度药物各100μl于96孔板中。

（2）吸取100μl新鲜菌液（10⁶cfu/ml）加入到各加药孔中，然后用太阳光模拟器（波长295-2500nm、功率80mw/cm²）照射1min，光剂量为4.8j/cm²。

（3）照射完后，在28℃、200rpm转速下继续培养24小时后，化合物最小抑菌浓度对应为细菌不再生长的最低浓度。实验设定三个复孔，并重复三次。

表1为光照条件下复合抗菌药剂对柑橘溃疡菌的最小抑菌浓度（mic）。如表1所示，复合抗菌药剂使用的剂量相比铜盐至少降低了22倍。

表1不同药剂对柑橘溃疡菌的最低抑制浓度

实施例4：复合抗菌药剂在预防与防治植物感染的实验

（1）复合抗菌药剂用pbs溶液稀释至90μg/ml，并用硫酸铜做阳性对照，pbs做空白对照。

（2）按照《农药生物活性测定标准操作规范（sop）》，采用已种植2年以上的茂戊柑感病品种盆摘作为实验材料。选取大小相当，颜色相似，长势相同的嫩叶作为实验接种对象，在接种之前先对叶片表面消毒。将树叶分为三组：复合药剂组、硫酸铜组、pbs组。

（3）将复合抗菌药剂(90μg/ml)、硫酸铜盐（1mg/ml）及pbs分别均匀喷洒于叶片表面，并在自然条件下风干，然后将柑橘溃疡病菌（10⁸cfu/ml）均匀喷洒于叶片，其中复合药剂组用太阳光模拟器照射10min（波长295-2500nm、功率80mw/cm²），光剂量为48j/cm²后，与其他处理组植物共同置于室温、自然光条件下培养，常规的水肥管理。

（4）待接种30天后，药物的防治效率通过计算菌落数/每平方厘米来评估，结果见表2。

表2不同药剂对植物感染的防治效率

由表2可见，pbs对照组的防治效率为5.03，cuso4对照组的防治效率为0.33，复合抗菌药剂的防治效率为0.26，说明复合抗菌药剂对柑橘溃疡菌有明显的杀伤作用，但铜盐对叶片有一定的毒性，而复合抗菌药剂对叶片基本无毒。

（5）用复合抗菌药剂及硫酸铜溶液分别处理已接种柑橘溃疡病菌35天的部分pbs对照组叶片。其中复合抗菌药剂处理组用太阳光模拟器照射10min（波长295-2500nm、功率80mw/cm²）一天后，采用三区划线法：将新鲜病叶用70%的酒精消毒60s，经无菌水漂洗后，取病叶中的单个病斑，切取大小约为4mm²健病交界处的叶片，放入装有1mlpbs溶液的离心管中并用玻璃棒捣碎，混匀待用。将制备好的病菌悬液用稀释法进行涂皿培养，稀释梯度为10×、100×、1000×和10000×，取100μl各梯度的稀释液涂布于na固体培养基，于28℃条件下培养，每个病变的细菌数量被计算并转换为log10（cfu）/菌落。

由图4结果可见，复合药剂可以杀死90%的细菌（杀灭对数值为1）。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。