一种菊花玻璃化组培苗复壮的方法与流程

本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及两种菊花玻璃化组培苗复壮的方法。

背景技术：

菊花(chrysanthemummorifolium)为菊科菊属多年生宿根草本，花色花型丰富、品种多样且花期长，是我国十大传统名花和世界四大切花之一。菊花具有观赏、食用、药用等多种价值，人们最早认识菊花是从药用和饮用开始的，早在两汉时的《神农本草经》便有相关记载，因其散风清热、平肝明目和清热解毒等功效而广受喜爱。

菊花传统繁殖方式多采用分株、扦插等无性繁殖方法，易受环境影响，繁殖速率低、周期长，且幼苗良莠不齐。随着市场需求的急剧增加，分株和扦插已经不能满足市场发展的需要。植物组织培养具有增殖效率高、繁殖速度快的特点，可以快速获得大量试管苗，实现菊花的规模化生产，具有很高的经济效益和社会效益。

植物组织培养是将植物体的一部分接种在培养基上，使其按预定目标发育成新植株。植物组织培养由于周期短，增殖率高且能全年生产等优点，越来越多的应用于种苗生产。但长期以来，组培苗在培养过程中易出现污染、褐化、玻璃化及顽拗等现象，严重阻碍着组培技术的广泛应用。尤其是组培苗玻璃化，是植物组培过程中亟待解决的问题。

菊花玻璃化组培苗矮小肿胀，整株没有节间或节间很短，叶片和嫩梢呈水浸状、半透明状或玻璃状，叶片增厚且易脆。组培苗玻璃化后因组织结构和生理功能异常，增殖系数低，生根困难，移栽难以成活，生产中的菊花玻璃化苗往往被丢弃，增加了生产成本，严重影响菊花组培苗的规模化生产。

对大多数植物而言，组培苗产生玻璃化的原因是多样的，细胞分裂素浓度、培养基类型、碳源种类及含量、琼脂浓度、活性炭、高温、高湿，光照不足等因素均易导致玻璃化苗的产生。因此，降低组培苗玻璃化的常用措施有降低培养基中细胞分裂素浓度，控制适宜的温度，选择合适的碳源，使用透气性好的封口材料，适当增加琼脂浓度，及增加光照等。由于不同植物出现组培苗玻璃化的原因不尽相同，对应的预防措施也不同，有必要对菊花玻璃化组培苗展开相应的研究，形成有针对性的有效防控措施。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种成本低、操作简便的菊花玻璃化组培苗复壮的方法,能够有效提高菊花组培苗增殖系数、良好的解决菊花增殖培养过程中发生的组培苗玻璃化现象。

一种菊花玻璃化组培苗复壮的方法，包括如下步骤：

(1)菊花舌状花消毒接种，在诱导分化培养基上进行诱导培养，获得愈伤组织，进而分化出再生植株；

(2)筛选玻璃化苗复壮培养基，将分化后形成的中度玻璃化植株转接到所述玻璃化苗复壮培养基中，复壮培养后得到复壮组培苗。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，所述玻璃化苗复壮培养基为：ms基本培养基+0.2mg/l6-ba+1-5g/l活性炭+6g/l琼脂+20-40g/l蔗糖，培养容器选择100ml的玻璃三角瓶，以封口膜作为封口材料。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，所述玻璃化苗复壮培养基包括第一玻璃化苗复壮培养基和第二玻璃化苗复壮培养基，采用第一玻璃化苗复壮培养基培养10～20天后，再采用第二玻璃化苗复壮培养基培养10天，得到复壮组培苗；

所述第一玻璃化苗复壮培养基为：ms基本培养基+0.2mg/l6-ba+1-5g/l活性炭+6g/l琼脂+20-40g/l蔗糖；

所述第二玻璃化苗复壮培养基为：ms基本培养基+0.2mg/l6-ba+6g/l琼脂+20-40g/l蔗糖；

培养容器选择100ml的玻璃三角瓶，以封口膜作为封口材料。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，步骤(1)中选取甘菊和长裂太行菊半开放到开放时期的花朵，用含少量洗洁精的自来水浸泡30min，之后用自来水冲洗60min，转至超净工作台进行灭菌处理。具体灭菌处理方法为：先用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后用4％naclo震荡洗涤10min，最后用无菌水冲洗3-4次。接种时，将消毒后花朵置于无菌培养皿中，用镊子剥去苞片，解剖刀将总花托切去，取下花瓣，之后将分散的花瓣逐个接入固体ms培养基中，每瓶接种8-10个花瓣，进行愈伤组织的诱导培养。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，步骤(2)中所述中度玻璃化植株，具体表现为不大于1/3的叶片和茎上部玻璃化，呈透明肿胀；取所述中度玻璃化植株，剪成1.0-1.5cm小段后接入玻璃化苗复壮培养基中进行复壮培养。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，步骤(2)中玻璃化苗复壮培养基的筛选过程包括如下步骤：所用到的玻璃化苗复壮培养基以不添加任何激素的ms为基本培养基，分别以6-ba、蔗糖、琼脂、活性炭、培养容器及封口材料为试验因素，不考虑因子间的交互作用，以5因素4水平正交试验l(4⁵)正交表设计。6-ba浓度分别设0mg/l，0.1mg/l，0.2mg/l，0.5mg/l；蔗糖用量分别为20、30、40、50g/l；琼脂用量分别为6、8、10、12g/l；活性炭用量分别为0、1、3、5g/l；不同的培养容器及封口材料设定为：200ml圆口瓶配不透气塑料盖，200ml圆口瓶配透气塑料盖，200ml圆口瓶配封口膜，100ml三角瓶配封口膜得到用于筛选的各处理培养基。

将分化形成的中度玻璃化组培苗进行复壮培养，具体表现为不大于1/3的叶片和茎上部玻璃化，呈透明肿胀，剪成1.0-1.5cm小段，接种到各处理培养基中，每处理8瓶，每瓶接5株，重复3次。每隔10d进行外植体的形态观测，查看玻璃化苗恢复程度，统计恢复正常的苗数和轻度玻璃化苗数，培养30d后，统计玻璃化苗恢复率。

玻璃化苗恢复率＝(轻度玻璃化苗数+已恢复正常苗数)/接种苗数×100％；

轻度玻璃化表现为：上部叶片玻璃化，呈半透明水渍状，叶色较淡，茎未发生玻璃化；恢复正常的组培苗没有玻璃化，长势较为健壮。

根据统计结果进行分析得到玻璃化苗复壮培养基。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，步骤(1)中所述诱导分化培养基配方为：ms基本培养基+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+8mg/l琼脂+30mg/l蔗糖，培养基ph值5.5-6.0，培养温度(25±1)℃，每日光照14h，10h黑暗，光照强度1600-2000lx，每25-30d转接1次进行继代培养。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，所述菊花为甘菊或长裂太行菊。

本发明所述的菊花玻璃化组培苗复壮的方法，其中，继代培养2～3次后进行复壮培养。

本发明菊花玻璃化组培苗复壮的方法与现有技术不同之处在于：本发明菊花玻璃化组培苗复壮的方法对培养基6-ba浓度、蔗糖浓度、琼脂浓度、活性炭添加量及封口材料与甘菊和长裂太行菊玻璃化苗复壮的关系进行了研究，探索一种控制菊花试管苗玻璃化的组培复壮方法，能够有效提高菊花试管苗增殖系数、良好的解决菊花增殖培养过程中发生的组培苗玻璃化现象。

下面结合附图对本发明的菊花玻璃化组培苗复壮的方法作进一步说明。

附图说明

图1为本发明菊花玻璃化组培苗复壮方法中的重度玻璃化、中度玻璃化、轻度玻璃化和恢复正常的组培苗；

a：重度玻璃化：组培苗茎、叶片、叶柄严重玻璃化，组培苗畸形；

b：中度玻璃化：约1/3或略少于1/3的叶片和茎上部玻璃化，呈透明肿胀；

c：轻度玻璃化：上部叶片玻璃化，呈半透明水渍状，叶色较淡，茎未发生玻璃化；

d：组培苗全部逆转：没有玻璃化，长势较为健壮。

具体实施方式

实施例1

9-10月选取生长健壮的甘菊和长裂太行菊半开期到盛开期的花朵，用含少量洗洁精的自来水浸泡30min，之后用自来水冲洗60min，转至超净工作台进行灭菌处理。具体灭菌处理方法为：先用70％乙醇处理30s，无菌水冲洗3次后用4％naclo震荡洗涤10min，最后用无菌水冲洗3-4次。接种时，将消毒后花朵置于无菌培养皿中，用镊子剥去苞片，解剖刀将总花托切去，取下花瓣，之后将分散的花瓣逐个接入固体ms培养基中，每瓶接种8-10个花瓣，进行愈伤组织的诱导培养。用到的诱导培养基为：ms基本培养基+2.0mg/l6-ba+0.5mg/lnaa+8.0mg/l琼脂+30mg/l蔗糖，培养温度(25±1)℃，外植体接种后培养温度(25±1)℃，每日光照14h，10h黑暗，光照强度1600-2000lx。每25-30d转接1次,所用培养基、培养条件与初代培养相同。

继代2-3次后，将分化形成的中度玻璃化组培苗进行复壮培养，所用到的玻璃化苗复壮培养基以不添加任何激素的ms为基本培养基，分别以6-ba、蔗糖、琼脂、活性炭、培养容器及封口材料为试验因素，不考虑因子间的交互作用，以5因素4水平正交试验l(4⁵)正交表设计，16个处理如表1所示。

表1不同外源添加物及封口材料处理

取甘菊和长裂太行菊的中度玻璃化苗，如图1所示，具体表现为约1/3或略少于1/3的叶片和茎上部玻璃化，呈透明肿胀。剪成1.0-1.5cm小段，接种到各处理中，每处理8瓶，每瓶接5株，重复3次。每隔10d进行外植体的形态观测，查看玻璃化苗恢复程度，统计恢复正常的苗数和轻度玻璃化苗数。培养30d后，统计玻璃化苗恢复率。轻度玻璃化：上部叶片玻璃化，呈半透明水渍状，叶色较淡，茎未发生玻璃化。恢复正常的组培苗没有玻璃化，长势较为健壮。

采用sas9.4数据处理系统进行单因素方差分析。

由表2可知，通过对甘菊玻璃化组培苗恢复的f统计量值分析得出，各因素对甘菊玻璃化苗逆转率影响的大小顺序依次为：6-ba>琼脂>活性炭>蔗糖>封口材料，对长裂太行菊玻璃化组培苗恢复的f统计量值分析得出，各因素对长裂太行菊玻璃化苗逆转率影响的大小顺序依次为：6-ba>蔗糖>琼脂>活性炭>封口材料，各因素对甘菊和长裂太行菊的玻璃化苗逆转率的影响顺序稍有不同，可能与品种间的基因型差异有关。而恢复率方差分析结果可知，6-ba、琼脂、活性炭、蔗糖和封口材料对甘菊和长裂太行菊玻璃化组培苗复壮的影响都达到了极显著水平(p<0.0001)。

表2甘菊和长裂太行菊玻璃化组培苗复壮正交试验结果

表3甘菊和长裂太行菊玻璃化组培苗复壮方差分析结果

由表2和表3可知，6-ba浓度对甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的复壮影响最大。随着6-ba浓度的增加，甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的逆转率都是先增加后降低的。当培养基中不含6-ba时，甘菊和长裂太行菊的组培苗生长缓慢，且增值率低。在6-ba为0.2mg/l时，甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的逆转率达到39.88％和34.04％，苗增殖芽数多且长势较好。随着6-ba浓度提高到0.5mg/l时，增殖芽数最多，但玻璃化苗明显增加，叶片多表现为畸形水浸状，苗的逆转率也相对降低。综合分析认为，培养基中高浓度的6-ba诱导了玻璃化苗的发生，维持较低浓度的6-ba对于降低玻璃化苗发生比例极为关键。考虑到培养基中低浓度的6-ba还降低了组培苗长势，不利于组培苗的生长，因此，0.2mg/l对于维持甘菊和长裂太行菊组培苗正常的诱芽与植株生长最为有利。

由表2和表3可知，蔗糖浓度对甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的复壮有显著影响，原因可能是培养基中蔗糖浓度的提高，可以降低培养基中的渗透势，阻碍细胞过度吸水，从而降低玻璃化苗的比例，同时适当增加蔗糖含量也弥补了试管苗在弱光下有机营养的不足。在20-40g/l范围内，蔗糖浓度对甘菊玻璃化苗的逆转率差异不显著，组培苗生长正常健壮，而长裂太行菊在蔗糖浓度为40g/l时组培苗恢复率要略好于20g/l和30g/l。当蔗糖浓度为50g/l时，甘菊和长裂太行菊的增殖系数和逆转率明显降低，可能是碳源过剩，不利于分化。综合增殖系数和玻璃化两个指标来看，选择蔗糖浓度为20-40g/l比较适宜。

由表2和表3可知，琼脂浓度对甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的复壮影响显著。在6-12g/l范围内，随着琼脂浓度的增加，甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的恢复率是逐渐降低的，这与前人在其它科、属的研究结论不太一致，可能与供试材料菊科的基因型差异有关。一般而言，琼脂的浓度会影响培养基的水势。琼脂浓度低，培养基水势较高，试管苗容易产生玻璃化现象。但是本试验发现，在甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的恢复过程中，琼脂6g/l时，玻璃化苗恢复少，但增殖芽数较多，新增殖苗多为轻度玻璃化苗及恢复正常的组培苗，苗的逆转率相对降高。随着琼脂浓度增加，增殖芽数明显减少，在琼脂为8g/l和10g/l时，甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的逆转率有所降低，组培苗长势较好。随着琼脂浓度提高到12mg/l时，甘菊和长裂太行菊的组培苗植株生长势差，叶片黄绿，增殖芽数最少且苗高明显降低，这可能是培养基中琼脂含量过高，导致培养基硬度过大，植株难以吸收营养。因此，综合增殖系数和玻璃化两个指标来看，选择琼脂浓度为6g/l比较适宜。

由表2和表3可知，活性炭浓度对甘菊和长裂太行菊玻璃化苗的复壮有显著影响。当培养基中不含活性炭时，甘菊和长裂太行菊组培苗逆转率相对较低。培养基中添加活性炭后，在1-5g/l范围内，甘菊玻璃化苗逆转率显著升高，长裂太行菊玻璃化苗逆转率略有提升，组培苗的玻璃化程度都有所改善，丛生芽长势良好且叶片数量增多。但试验中发现，添加活性炭后个别组培苗叶片有枯黄萎焉的现象，可能是因为活性炭有较强的吸附作用，在吸收培养基有害物质的同时，也吸附培养基中的营养物质，从而导致组培苗枯黄、萎焉。综合分析认为，添加活性炭有利于组培苗玻璃化的克服，但考虑到它有一定的副作用，建议短时间内使用。

由表2和表3可知，不同的培养容器及封口材料对甘菊和长裂太行菊玻璃化苗复壮的影响差异显著，甘菊的玻璃化苗在使用以封口膜作为封口材料100ml玻璃三角瓶时，逆转率较高，使用200ml的圆口瓶时，三种封口材料(不透气塑料盖、透气塑料盖和封口膜)对甘菊玻璃化苗的逆转率影响差异较小。长裂太行菊的玻璃化苗在使用以透气塑料盖作为封口材料的200ml圆口瓶和以封口膜作为封口材料的100ml玻璃三角瓶时逆转率较高。试验中发现，使用不透气塑料盖时，瓶壁周围有较多水珠，瓶内湿度较大，组培苗徒长且叶片皱缩卷曲、畸形严重。使用透气塑料盖和封口膜时，相对湿度明显降低，组培苗徒长和畸形现象明显改善。综合分析认为，培养容器选择100ml的玻璃三角瓶，以封口膜作为封口材料较为适合，此时严重玻璃化的组培苗比例最低，与其他三种处理的差异显著，瓶内透气性较好，有利于组培苗生长。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。