一种昆虫病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂与流程

本发明属于微生物领域，具体涉及一种昆虫病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂。

背景技术：

昆虫病原真菌作为一种常用的生物防治菌种，被广泛应用于害虫防治，目前已有很多成功的案例，金龟子昆虫病原真菌(metarhiziumanisoliae)、黄绿昆虫病原真菌(m.flavoviride)和罗伯特昆虫病原真菌(m.robertsii)等菌种对葡萄黑象甲(otiorhynchussulcatus)、蟋蟀(anabrussimplex)、小菜蛾(plutellaxylostella)、灰飞虱(laodelphaxstriatellus)等鞘翅目、直翅目、鳞翅目、半翅目的昆虫皆有侵染作用。双斑长跗萤叶甲(monoleptahieroglyphica)是杂食性害虫，取食范围广，目前有一些关于化学防治的报道，但尚未见生物防治的报道。玉米蚜(rhopalosiphummaidis)除了取食叶片、吸取玉米汁外，还会分泌大量蜜露，影响作物的光合作用，被害植株长势变弱，产量下降，目前玉米蚜的防治主要以化学防治为主，农药喷施过多，会影响生态环境并且会杀死部分有益微生物。因此寻找一株具有防治害虫潜力的真菌，可减少化学农药的使用。

技术实现要素：

为了避免化学防治害虫的方法对生态环境的影响，本发明提供了一种昆虫病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂。

本发明提供了一种昆虫病原真菌在害虫防治中的应用，所述昆虫病原真菌是马昆德马昆德菌(marquandomycesmarquandii)，菌株编号为sgsf043，菌种保藏编号为cctccno.m2020555。

进一步地限定，所述害虫为双斑长跗萤叶甲(monoleptahieroglyphica)、绿豆象(callosobruchuschinensis)和玉米蚜(rhopalosiphummaidis)中的一种或两种以上。

本发明还提供了一种应用是利用所述昆虫病原真菌制备杀灭或抑制害虫的杀虫剂。

进一步地限定，所述害虫为双斑长跗萤叶甲(monoleptahieroglyphica)、绿豆象(callosobruchuschinensis)和玉米蚜(rhopalosiphummaidis)中的一种或两种以上。

本发明还提供了一种防治害虫的方法，所述方法包括利用菌种保藏编号为cctccno.m2020555的昆虫病原真菌的孢子悬液处理害虫的步骤。

进一步地限定，所述害虫为双斑长跗萤叶甲(monoleptahieroglyphica)、绿豆象(callosobruchuschinensis)和玉米蚜(rhopalosiphummaidis)中的一种或两种以上。

进一步地限定，所述处理害虫的条件是24℃-26℃、相对湿度65％-75％和24h全黑暗。

进一步地限定，所述菌种保藏编号为cctccno.m2020555的昆虫病原真菌的孢子悬液的制备方法为：将所述昆虫病原真菌菌种接于pda培养基上培养，然后在培养基上加入吐温80水溶液，刮取表面孢子，得到孢子悬液。

进一步地限定，所述孢子悬液的浓度为1×10⁸个/ml。

本发明还提供了一种杀虫剂，所述杀虫剂有效成分为昆虫病原真菌，菌株编号为sgsf043，保藏编号为cctccno.m2020555。

附图说明

图1.sgsf043号菌株菌落图；

图2.sgsf043号菌株侵染害虫后在其表面形成的菌丝特征图，其中a是sgsf043号菌株侵染双斑长跗萤叶甲后在其表面形成的菌丝特征图，b是sgsf043号菌株侵染玉米蚜后在其表面形成的菌丝特征图，c是sgsf043号菌株侵染绿豆象后在其表面形成的菌丝特征图；

图3.sgsf043号菌株毒力测定结果图，其中a为侵染双斑长跗萤叶甲的毒力测定；b为侵染玉米蚜的毒力测定；c为侵染绿豆象的毒力测定。

具体实施例

本发明选用的是一种昆虫病原真菌：马昆德马昆德菌(marquandomycesmarquandii)，菌株编号为sgsf043，保藏时间是2020年9月29日，保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏地点为湖北省武汉市武昌区八一路199号武汉大学保藏中心，保藏编号cctccno.m2020555。

1.实验材料：双斑长跗萤叶甲害虫、玉米蚜害虫和绿豆象害虫都是来自于黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院科研试验基地，双斑长跗萤叶甲和玉米蚜在玉米上收集，绿豆象是在室内人工饲养。

2.试验材料：吐温80是商业购买的。

3.试验试剂配制：

马铃薯葡萄糖培养基(pda)：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，定容至1l。

麦芽提取物琼脂培养基(mea)：麦芽浸粉30g，琼脂20g，水1l。

平板计数琼脂培养基(pca)：胰蛋白胨5g，酵母浸粉2.5g，葡萄糖1g，琼脂20g，水1l。

萨氏培养基(sday)：酵母浸粉10g，葡萄糖40g，蛋白胨10g，琼脂20g，1l水。

燕麦培养基(oa)：燕麦30g，琼脂20g，水1l。

马铃薯葡萄糖液体培养基(pd)：马铃薯200g，葡萄糖20g，定容至1l。

实施例1.

一、昆虫病原真菌的分离方法

一株昆虫病原真菌(sgsf043)分离自大兴安岭林下凋落物。将在大兴安岭采集的林下凋落物样品干燥后粉碎成颗粒，用滤网过滤得到凋落物样品颗粒大小在100-200μm的颗粒。利用颗粒平板稀释法，将颗粒状的样品与无菌水按照1:100的质量比混合，制备成颗粒混悬液。再用移液枪吸取50μl、100μl、150μl、200μl和250μl分别涂抹至pda培养基平板，用涂布棒涂布至颗粒均匀分散，放置于室温下培养，每12h观察一次，待真菌菌落长出，将菌落挑取至pda平板，进行纯化。经过显微镜观察形态，its和tef序列扩增测序，最终分离鉴定了1株昆虫病原真菌，将昆虫病原真菌保存于冻存管内。

二、菌株的分子生物学鉴定

首先对已纯化的菌株利用ctab法提取总dna，然后利用真菌通用引物its1、ts4对内转录间隔区(internaltranscribedspacer，its)进行pcr扩增，用于初步鉴定，its引物为its1(序列如seqidno.1所示，即5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’)和its4(序列如seqidno.2所示，即5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)。由于对于昆虫病原真菌属来说，翻译延伸因子1-α(translationelongationfactor1-α，tef)比its序列含有更多的昆虫病原真菌种间差异的信息，所以利用引物ef-983f(序列如seqidno.3所示，即gcyccygghcaycgtgayttyat)和ef-2218r(序列如seqidno.4所示，即atgacaccracrgcracrgtytg)进一步对目标昆虫病原真菌的tef序列片段进行扩增。pcr产物经电泳检测后，送至测序公司双向测序。将测序后获得的可信序列，利用ncbi网站的blast(basiclocalalignmentsearchtool，https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)进行比对分析。对昆虫病原真菌的its片段以及tef片段进行扩增，通过blast工具进行比对，sgsf043号菌株最相近菌种为马昆德马昆德菌(marquandomycesmarquandii)(曾用名metarhiziummarquandii)，结果如表1所示，相似性为100％。

表1菌株sgsf043的分子鉴定结果

三、菌株的形态学鉴定

将分离纯化获得的昆虫病原真菌菌株转接至pda、mea、sday、oa、pca培养基上，培养14天后，记录昆虫病原真菌的生长速率、菌落大小、颜色及菌落特征。利用光学显微镜观察真菌在不同培养基及其不同昆虫表面形成的真菌孢子、色素与渗出物、产孢结构与菌丝等特征，对比相关文献进行形态学鉴定，结果如图1和图2所示，菌落正面呈白色棉花状，无褶皱，未见明显色素与渗出物产生；菌落背部为浅黄色，分生孢子为卵圆形，大小为(2.11～4.31)μm×(1.85～3.04)μm；在pd(马铃薯葡萄糖液体培养基)液体培养基可见圆形厚垣孢子，体式显微镜下，分生孢子梗多级分支，侵染昆虫后首先从腹部长出白色菌丝，后产生白色产孢结构与分生孢子，遍布全身。结合形态学特点和分子鉴定结果，可以确定sgsf043号菌株为马昆德马昆德菌(marquandomycesmarquandii)(曾用名metarhiziummarquandii)。

三、昆虫病原真菌的生物学特性

1.不同温度下菌株生长速率及产孢量测定

将纯化的sgsf043号菌株用打孔器打孔并转接至pda培养基，分别置于20℃、25℃和30℃培养箱，每个处理重复三次，每天定时测量菌落生长直径，共测量14d。测量实验结束时在平板上加入5ml灭菌的1％吐温80水溶液，刮取表面孢子，用无菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板测定产孢量。

表2、3为不同温度下菌株的生长直径和产孢量测定结果，由表2可知，菌株sgsf043的最适生长温度为25℃，培养14d后菌落直径达到44mm，在20℃时生长直径略小于25℃，但30℃时菌株生长轻微减慢，根据表3产孢量结果可知，温度对其影响较小，在25℃时产孢量最大。

表2不同温度下菌株的生长直径测定结果

注：单位为mm，菌落直径已去除菌饼直径6.5mm。

表3不同温度下菌株的产孢量测定结果

注：单位为“个”，表中数据为每个pda培养基培养14天后总产孢量

2.不同ph下菌株生长速率及产孢量测定

将纯化的sgsf043号菌株用打孔器在菌落上打孔，分别转接至ph为4、5、6、7、8、9的pda培养基，每个处理重复三次，置于25℃培养箱培养14d，每天定时测量菌落生长直径。测量实验结束时在平板上加入5ml灭菌的1％吐温80水溶液，刮取表面孢子，用无菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板测定产孢量。

表4、5为sgsf043号菌株在不同ph下的生长速率和产孢量的测定结果，根据表4结果可知，sgsf043号菌株受ph影响较大，菌株在碱性条件下生长状态明显优于酸性培养条件，在ph8和9时生长直径增加，根据表5结果可知，在ph8和9时产孢量也显著增加，因此sgsf043号菌株适合在ph偏碱性的条件下生长。

表4不同ph下菌株的生长直径测定结果

注：单位为mm，菌落直径已去除菌饼直径6.5mm。

表5不同ph下菌株的产孢量测定结果

注：单位为“个”，表中数据为每个pda培养基培养14天后总产孢量。

实施例2.抗害虫活性测定的方法

一、制备昆虫病原真菌的孢子悬液的方法

首先制备孢子悬液，将菌种接于pda培养基上培养14d后，平板上加入5ml的灭菌的0.05％吐温80水溶液，刮取表面孢子。用灭菌棉花过滤掉多余菌丝体和琼脂后，利用血球计数板计数，将孢子悬浮液最终调整至浓度为1×10⁸个/ml。

二、昆虫病原真菌的孢子悬液处理害虫的方法

将双斑长跗萤叶甲(成虫)浸泡在1×10⁸个/ml浓度的孢子悬液中5s，然后转移至装有玉米粒的三角瓶内观察，每个处理接种35只成虫。将绿豆象(成虫)浸泡在1×10⁸spores/ml(spores孢子数)浓度的孢子悬液中5s，然后用毛笔转移至装有绿豆的三角瓶内观察，每个处理接种20只成虫。用毛笔将无翅玉米蚜转移至培养皿内，采用喷雾法，将1×10⁸个/ml孢子悬液均匀的喷洒在虫子体表，每次喷洒1ml孢子悬液，再将处理过的玉米蚜转移至甘蓝叶上，每个处理接种4只玉米蚜。各处理重复三次，用灭菌的0.05％吐温80水溶液作为溶剂对照。完成接种后，所有三角瓶转移至25±1℃，相对湿度70％±5％，24h全黑暗条件的培养箱内培养，每日统计死亡率与校正死亡率，并将死虫转移至铺有无菌湿润滤纸的培养皿内观察昆虫病原真菌侵染情况。

对双斑长跗萤叶甲和玉米蚜成虫进行了毒力测定，结果如图3中的a和表6所示，sgsf043号菌株对双斑长跗萤叶甲有较高的致死率，死亡率随接种时间逐渐增加，接种处理第8天累积校正死亡率达到91.55％，致死中时间在3天左右，接种8天后僵虫率在90％以上。

根据玉米蚜在接种处理第3天时，结果如图3中的b和表6所示，致死率达到100％，最终僵虫率在70％以上。

根据绿豆象接种实验发现，结果如图3中的c和表6所示，sgsf043号菌株在侵染绿豆象第8天时校正死亡率达到50％以上。这一部分结果证实，sgsf043号菌株具有良好的抗虫活性，可以侵染多种害虫，防治范围广，属于非寄主专化型昆虫病原真菌，表明该菌株具有良好的害虫的生物防治潜力，可用作生防菌株。

表6sgsf043号菌株抗虫活性测定结果

sequencelisting

<110>黑龙江省农业科学院齐齐哈尔分院

<120>一种昆虫病原真菌的应用、防治害虫的方法及杀虫剂

<130>

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>its1

<400>1

tccgtaggtgaacctgcgg19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>its4

<400>2

tcctccgcttattgatatgc20

<210>3

<211>23

<212>dna

<213>ef-983f

<400>3

gcyccygghcaycgtgayttyat23

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>ef-2218r

<400>4

atgacaccracrgcracrgtytg23