利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法与流程

本发明属于水稻高温耐受性评价技术领域，尤其涉及一种利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法。

背景技术：

目前，高产与优质是中国水稻育种的两个重要目标。目前中国水稻生产已经达到较高水平，但随着国民生活水平和消费水平的提高，对稻米品质尤其是蒸煮食味品质提出了更高的要求，育种家也将育种目标由过去单纯提高产量转移到在保证水稻产量稳步增长的基础上提高稻米品质，培育具有优良品质的水稻品种成为了中国水稻育种工作的重要目标。

全球气候变暖已成为一个不争的事实，由co2和其它温室气体导致的温室效应，使地球表面的温度自1880年以来一直上升。根据诸多模型预测，本世纪末地球表面温度将升高1.8℃-4.5℃，温度的持续升高已经成为影响全球粮食作物生产的主要因素，威胁着世界粮食的产量安全和品质安全。全球气候变暖导致水稻生长季温度升高，尤其水稻生长过程中的开花期和灌浆结实期对温度最为敏感，灌浆期遭受过高的温度将严重影响稻米品质。在全球气候变暖的高温条件下如何进一步改良稻米品质，培育优质并且耐高温的水稻品种以满足人们日益增长的对稻米品质的要求是本发明面临的重大挑战。

稻米淀粉的理化特性是决定稻米品质的重要因素。蒸煮食味品质是构成稻米品质的重要方面，它与稻米淀粉的组成和理化特性密切相关。稻米胚乳中的淀粉主要包含两类，即直链淀粉和支链淀粉，其中直链淀粉一直被公认为评价稻米品质的重要指标。据实验，在一定范围之内，直链淀粉含量越高，米饭质地越硬，相反，直链淀粉含量越低，米饭质地越软。但是也有些品种的直链淀粉含量相似，但米饭质地却相差甚远，这主要是因为，米饭的质地在受直链淀粉的影响的同时，也与支链淀粉的链长分布密切相关。不同质地的稻米，其淀粉的链长分布也不同，一般淀粉的长链(来自直链淀粉、支链淀粉或者中间型淀粉)越长、越多，米饭质地越硬，米饭表现越干。

稻米淀粉由离散的颗粒组成，称为淀粉颗粒，通常为多面体形，不同的水稻品种淀粉颗粒大小差异很大。淀粉颗粒是一种具有半结晶性质的颗粒，影响淀粉的组成、结构、糊化特性、结晶度、黏度特性、膨胀力和水溶性指数。影响淀粉结晶度的因素主要是直链淀粉、直链淀粉短侧链与长侧链之间的比例。稻米淀粉具有热力学特性，主要是指淀粉在糊化过程中发生的热力学变化的特性，其一般利用差示扫描热量仪(dsc)来测定，测定的指标通常为淀粉的糊化温度(起始温度、峰值温度、终止温度)和糊化焓，峰的面积则为糊化所需要的焓变(j/g)。糊化特性是淀粉蒸煮食味品质的重要指标，反应了稻米在蒸煮时的难易程度。稻米淀粉具有黏度特性，是决定稻米蒸煮食味品质的重要指标之一，一般采用快速粘度分析仪(rva)测定淀粉的黏度特性。rva谱是指米粉浆或者淀粉匀浆在加热、高温和冷却的过程中黏度随着温度变化而形成的曲线，其特征值在稻米食味品质评价中具有重要的应用价值，主要包含峰值粘度(pv)、谷值粘度(hpv)、冷胶黏度(cpv)、崩解值(bd)和消减值(sb)。通常，蒸煮食味品质好的品种pv高，cpv低，sb低、bd值高。另外rva谱值与稻米品质的其它指标，如aac、gc存在显著的相关性，通常将rva谱指标与aac和gc结合在一起作为筛选品质优良稻米的重要筛选依据，根据bd和sb的值可以用来评价aac含量相似的多个品种的品质优劣。

稻米垩白是评价稻米品质好坏的另一重要指标。垩白面积越大，稻米的透明度越差、硬度越低、碎米率越高、品质越差。前人实验认为，稻米垩白与稻米淀粉结构有关。稻米的垩白部分和非垩白部分的淀粉颗粒形状和排列方式不同，导致垩白部分的淀粉粒一般为球形或者近似球形、排列疏松、淀粉粒间隙较大，而非垩白部分的淀粉颗粒多呈多面体、排列紧密、淀粉粒间间隙较小。

水稻生长的灌浆期存在最适生长温度，过高的温度将影响稻米淀粉的理化特性，进而影响稻米品质。deng等认为水稻灌浆期的最适生长温度是22-27℃，超过27℃或低于22℃将不利于水稻的生长。wakamatsu等报道水稻抽穗后20天内的日均温高于27℃将增加稻米的垩白。灌浆结实期高温可以导致稻米淀粉结构疏松，颗粒间空隙变大，导致垩白增加、透明度降低、长宽比变小整精米率下降，蛋白质含量增加，耐热品种的受影响程度小于热敏感品种。另外，灌浆期高温使稻米淀粉的rva谱特征值最终粘度、消碱值和糊化温度升高，崩解值降低，峰值时间延长。高的灌浆温度可以使稻米的糊化温度、糊化焓升高，晶体结构改变，并且进一步实验发现这种变化可能与直链淀粉含量的变化密切相关。jiang等指出高温主要影响淀粉的积累和构成，而不会影响淀粉颗粒的数量。直链淀粉含量是影响稻米品质的最主要的因素，目前关于高温对直链淀粉含量的影响，有三种观点：1)认为高温使稻米直链淀粉含量降低；2)高温导致直链淀粉含量升高；3)高温对直链淀粉的影响因品种而异，灌浆期高温使带有高直链淀粉含量的品种直链淀粉含量增加和带有低直链淀粉含量的品种直链淀粉含量降低。

灌浆期不同时段高温对稻米品质的影响可能存在差异，这更有利于不同水稻品种在生产上通过微调播种期以有效减轻高温对稻米品质的影响，但当前的实验并无清晰的结论。徐富贤等分析齐穗后不同时段高温对稻米品质的影响发现水稻齐穗后的前20天是稻米品质对温度最敏感的阶段。程方民等实验指出水稻抽穗后的前20天里是温度对直链淀粉含量影响的关键阶段。朱碧岩等指出温度对稻米淀粉糊化温度影响的关键阶段在于水稻抽穗后的前20天内。而ambardekar和lanning等通过选用多个不同类型的品种在具有不同纬度的地点进行多年种植，得出了不同的观点，提出蜡质化时期(r7)与强势粒成熟期(r8)这两个属于灌浆中后期的阶段是高温对稻米品质指标影响最为关键的阶段。另外，白天高温与夜间高温对稻米品质的影响也不相同。

针对灌浆期高温影响稻米品质的实验已有一定进展，但存在以下几方面的问题：(1)从实验条件来看，多数实验是在半封闭或者封闭的温室中进行的，而在大田实际高温环境下进行的实验较少。(2)从实验内容方面来看，多数实验主要集中在加工、外观等指标上，通过这些指标来说明高温对品质的影响，而对影响稻米品质最重要的指标-淀粉理化性质的实验较少。(3)从实验深度来讲，过度强调外观等形态指标，忽略了蒸煮食味指标特别是淀粉理化性质和形态结构方面的深入探究。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：

(1)从实验内容方面来看，多数实验主要研究高温对不同水稻品种产量的影响，而高温对稻米品质的影响，特别是稻米淀粉理化特性的影响研究较少。针对不同水稻品种高温耐受性的评价，一般都是从结实率角度来解析，而从稻米品质角度评价的研究相对较少。

(2)从研究条件来看，现有针对灌浆期高温影响稻米品质的实验多数是在半封闭或者封闭的温室中进行的，而在大田实际高温环境下进行的实验较少。

(3)从实验深度来讲，过度强调外观等形态指标，忽略了蒸煮食味指标特别是淀粉理化性质和形态结构方面的深入探究。

解决以上问题及缺陷的难度为：要解决以上问题要做到以下几点：1、将大田分期播种与温室控温实验结合起来，大田分期播种实验可以更好的反应水稻品种的实际生长环境，可以准确有效的反应不同水稻品种的高温耐受程度。同时进行温室控温实验，可以帮助探索不同水稻品种耐高温能力的内在机理。2、从稻米品质角度，特别是稻米淀粉理化特性方面解析高温对不同水稻品种的影响，并对不同水稻品种的高温耐受程度进行评价。3、在研究加工和外观指标的基础上，着重研究稻米淀粉理化指标受高温影响的程度。

解决以上问题及缺陷的意义为：通过解决以上问题可以更真实有效的判断各水稻品种的高温耐受程度，为育种家培育具有优良品质的耐高温水稻品种提供参考。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法。

本发明是这样实现的，一种利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法，所述利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法包括以下步骤：

步骤一，采用六个生产上常用的水稻品种，分十个播种期播种，筛选不同品种不同播期变异系数大，且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标。

步骤二，以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，得到彼此独立的淀粉综合理化指标。

步骤三，通过spss软件求出各品种淀粉综合理化指标的综合得分及利用隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平，得到不同品种的耐高温综合评价值。

步骤四，以关键淀粉生理指标胁迫指数为自变量，以耐高温综合评价值为因变量，做回归方程，定量评价各品种的高温耐受性。

步骤五，通过定性和定量评价是否统一来综合评价不同水稻品种的高温耐受性。如统一，即可判定一组水稻品种高温耐受性的强弱顺序。如定性和定量结果不统一，即需要进一步的判定，即将不一致的水稻品种单独列为一组，再进行定量定性评价。

进一步，步骤一中，所述稻米淀粉理化特性的测定方法，包括：

(1)加工品质的测定：测产样品收获后，在室温条件环境内、阴凉通风处储藏3个月以平衡水分后，称量140g净稻谷使用稻谷砻谷机加工糙米并称重，计算糙米率。然后每份取100g糙米用精米机加工成精米并称重，计算精米率。利用图像分析软件sc-e分析得到整精米率。

(2)外观品质的测定：垩白度采取改良的扫描法测定，通过扫描仪得到整精米的扫描图像。然后用图像分析软件sc-e分析整精米的扫描图像，识别垩白粒的数量和面积。统计计算其垩白度、粒长、粒宽、长宽比等指标。

(3)淀粉的提取及直链淀粉含量测定。

(4)热力学特性的测定：精确称取淀粉10mg于氧化铝坩埚中，加入30μl无菌水，密封氧化铝坩埚，室温平衡24h后，使用差示扫描量热仪对样品进行糊化特性测试。设置仪器以10℃/min的速度，由30℃升温至95℃，扫描热量变化。

(5)粘度特性的测定。

(6)淀粉颗粒形貌和粒径大小分布的观察：用导电双面胶将淀粉粉末固定在金属样品平台，真空镀膜然后置于扫描电镜，以10kv电子束观察收集具有代表性的淀粉颗粒形貌照片。称取样品100-200mg于干净ep管中，加入1ml75％酒精，涡旋混匀后超声混匀。将混匀后的样品加入到mastersizer3000进行粒度分布测定，每样测定三次，收集数据。

(7)晶体结构的测定：利用x-射线衍射测定分析淀粉的晶体结构，将不同品种的淀粉样品平铺到样品池上，然后置于xrd测试平台上。测定条件：钨灯λ＝0.15406nm，功率1600w40kv×30ma，扫描速率4°/min，扫描范围4-35°。使用软件jade5.0计算测定样品的相对结晶度。

(8)水溶性指数和膨胀力的测定。

(9)数据统计分析：所得测定结果采用其平均值±标准偏差的形式，采用spss24.0统计软件对所得结果进行方差分析，主成分分析和构建回归方程，差异显著性分析采用ducan法，p<0.05表示差异显著。并且利用sas软件对稻米淀粉理化指标进行pearson相关性分析。

进一步，步骤(3)中，所述淀粉的提取及直链淀粉含量测定方法为：

a.淀粉的提取

将干燥的精米在含有0.14％的亚硫酸氢钠溶液水中浸泡过夜固液比1:5-1:10；加入用足量的0.14％的亚硫酸氢钠，用均浆机将精米研磨；将精米浆液过200目的尼龙网，将精米过滤后的浆液收集到离心瓶内；尼龙网用超纯水冲洗两次，将滤液与精米过滤后的浆液混合；3000r/min离心20min，倒掉上清；用超纯水再次悬浮淀粉后，3000r/min离心20min，倒掉上清；重复上一步3次；将淀粉晾干，结块后取出，放在55度烘箱快速烘干；将淀粉块用粉碎机粉碎，过200目筛子；干燥器保存。

b.直链淀粉含量的测定

本实验通过在720nm处测定与碘反应的淀粉样品的吸光值来测定其中直链淀粉的含量。其中以土豆直链淀粉和玉米支链淀粉含量作为标准样品制作标准曲线，直链淀粉含量根据标准曲线获得。

进一步，步骤(5)中，所述粘度特性的测定方法为：

取一定量的米粉或淀粉样品于快速粘度仪专用的圆筒形铝盒，加入25mlddh2o，配成以干基计、浓度为6％的米粉或淀粉乳。最初以960rpm的速度搅拌10s，然后减小到160rpm的速度旋转至测定结束。测定条件如下：50℃下保持1min，然后以12℃/min升温到95℃，在95℃保持2min，再以12℃/min速度降温到50℃，在50℃保持2min。

进一步，步骤(8)中，所述水溶性指数和膨胀力的测定方法为：

称取淀粉100mg至于一玻璃试管内，向试管内加入10ml的超纯水，充分悬浮震荡，95℃水浴30分钟，每隔5分钟，充分震荡一次。试管冷却到室温之后，3000g离心20分钟，上清液倒入一次性培养皿中，剩下的固体胶状物，称量重量，记为ws。培养皿中的上清液置于100℃烘箱内，烘干至恒重，记为w1。膨胀力用sp表示，水溶性指数用wsi表示。计算公式如下：wsi＝w1/0.1×100％；sp＝ws/[0.1×(100％-wsi)](g/g)。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受程度方法，通过筛选不同品种不同播期变异系数大，且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标，得到直链淀粉含量、糊化焓、崩解值、消减值和垩白度为对高温敏感的稻米淀粉的关键理化指标，以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，最后利用隶属函数值求出耐高温综合评价值，实验得到六个不同品种的耐高温综合评价值，并结合回归方程，定性定量评价这六个水稻品种高温耐受程度强弱顺序。

本发明采用大田分期播种与温室控温相结合的方式，全面系统解析灌浆期高温对稻米淀粉理化特性的影响机制，筛选与耐高温紧密关联的关键淀粉理化指标，建立不同品种高温耐受程度评价标准，为筛选和选育具有优良品质的耐高温水稻品种提供参考。

本发明采用生产上常用高产、优质稻作为实验材料，研究其受灌浆期高温影响的机理，挖掘与水稻耐高温相关的淀粉关键生理指标，建立不同品种耐高温评价标准，对水稻育种家选育优质高产耐高温水稻品种具有重要意义。同时采用分期播种方式和温室控温实验相结合，可获得更加真实可靠、应用价值高的数据。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受强度方法流程图。

图2是本发明实施例提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受性的技术路线示意图。

图3是本发明实施例提供的19q001-19q005第1、6、10播期和19q006的第6、7、10播期抽穗后30天日均温变化曲线示意图。

图4是本发明实施例提供的六个品种在ht1、ht2和ct条件下的支链淀粉含量的变化示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受强度方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受强度方法包括以下步骤：

s101，筛选不同品种不同播期变异系数大，且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标。

s102，以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，得到彼此独立的淀粉综合理化指标。

s103，通过spss软件求出各品种淀粉综合理化指标的综合得分及利用隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平，得到不同品种的耐高温综合评价值。

s104，以关键淀粉理化指标胁迫指数为自变量，以耐高温综合评价值为因变量，做回归方程，定量评价各品种的高温耐受性。

s105，通过定性和定量评价是否统一来综合评价不同水稻品种的高温耐受程度；如统一，即可判定一组水稻品种高温耐受性的强弱顺序；如定性和定量结果不统一，即需要进一步的判定，即将不一致的水稻品种单独列为一组，再进行定量定性评价。

本发明提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受强度方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的利用淀粉理化指标评价水稻品种灌浆期高温耐受强度方法仅仅是一个具体实施例而已。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的描述。

本发明前期实验采用黄华占、y两优957、天优华占、泰优390、y两优1号和中早39为实验材料，这些实验材料均由湖南杂交水稻研究中心提供。实验将这六个水稻品种于2018年和2019年分别分三个播期和十个播种期播种，筛选不同品种不同播期变异系数大，且在灌浆期高温和适温两种温度条件下方差显著的稻米淀粉理化指标作为关键指标，得到直链淀粉含量、糊化焓、崩解值、消减值和垩白度为对高温敏感的稻米淀粉的关键理化指标，以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，最后利用隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平，实验得到六个不同品种的耐高温综合评价值。

1、实验目标和实验内容

在前期的实验中，本发明已经以生产上常用的六个水稻品种为实验材料，研究灌浆期高温对稻米淀粉理化特性的影响，得到灌浆期高温使稻米淀粉的理化特性变差，进而导致稻米的蒸煮食味品质变劣。但是不同的稻米淀粉理化指标对灌浆期高温的响应差异和不同水稻品种对灌浆期高温的耐受性以及灌浆期高温对稻米淀粉的影响机理还不明确。因此，本项目在前期实验的基础上，以在生产上常用的高产或优质水稻品种为材料，以分期播种与温室控温相结合的方式，挖掘与水稻耐高温相关的淀粉理化指标，实验灌浆期昼夜高温和不同时段高温对稻米淀粉理化特性的影响规律，建立不同水稻品种耐高温程度评价方法，系统解析灌浆期高温对稻米淀粉理化特性的影响机理，为筛选和选育具有优良品质的耐高温水稻品种提供参考。重点开展以下几方面内容：

1.1开展灌浆期夜间高温对稻米淀粉理化特性影响的实验

选用耐高温水稻品种黄华占和y两优957，高温敏感品种9311和y两优1号，于抽穗期置于四个温室中处理30天：常温对照、夜间高温、白天高温和全天高温，对经过不同温室处理后的实验材料的稻米淀粉理化指标进行测定。

1.2开展灌浆期不同时段高温对稻米淀粉理化特性影响的实验

选用耐高温品种黄华占和高温敏感品种9311为实验材料，设置两个温室控温：高温处理室和适温处理室，实验灌浆前段(抽穗期前15天)和灌浆后段(抽穗第16天至成熟)高温对稻米淀粉理化特性的影响，挖掘灌浆期不同时段高温对稻米淀粉理化特性影响的差异，确定对稻米淀粉理化特性影响更大的灌浆时段。

1.3稻米耐高温关键淀粉生理指标的筛选及不同水稻品种高温耐受程度的评价

根据分期播种实验筛选灌浆期温差大且分别处于高温和适温两种条件下的两个播期，测定处于灌浆期高温和适温两种温度条件下，不同水稻品种稻米淀粉的组成、链长分布、淀粉粒结构、晶体特性、热力学特性和粘度特性等理化特性指标，同时结合温室控温实验，分析不同稻米淀粉理化指标对高温的响应差异，筛选受高温影响程度大的淀粉理化指标作为关键指标。以关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，最后利用隶属函数值求出耐高温综合评价值来定性评价不同品种的耐高温水平。同时以关键淀粉生理指标胁迫指数为自变量，以耐高温综合评价值为因变量，做回归方程，定量评价各品种的高温耐受性。

1.4不同品种高温耐受性评价方法的建立和常用水稻品种的耐高温评价

根据筛选的关键淀粉生理指标和六个水稻品种的定性和定量高温耐受性的评价结果，建立科学的耐高温评价方法。利用所得到的耐高温鉴定方法对22个生产上常用的高产或优质水稻品种进行耐高温评价，并将其作为选育品种过程中的一个重要鉴定标准，促进高效选育高产、优质和抗逆境胁迫兼顾的超级稻新品种。

2、技术方案

2.1稻米淀粉理化特性测定方法

按照国标ny/t83-2017米质测定方法测定相关指标。各指标均重复测定3次。

加工品质的测定：测产样品收获后，在室温条件环境内、阴凉通风处储藏3个月以平衡水分后，称量140g净稻谷使用稻谷砻谷机加工糙米并称重，计算糙米率。然后每份取100g糙米用精米机加工成精米并称重，计算精米率。利用图像分析软件sc-e分析得到整精米率。

外观品质的测定：垩白度采取改良的扫描法测定，通过扫描仪(microtekscanmakeri800plus)得到整精米的扫描图像。然后用图像分析软件sc-e分析整精米的扫描图像，识别垩白粒的数量和面积。统计计算其垩白度、粒长、粒宽、长宽比等指标。

淀粉的提取及直链淀粉含量测定：a.淀粉的提取将干燥的精米在含有0.14％的亚硫酸氢钠溶液水中浸泡过夜(固液比1:5-1:10)；加入用足量的0.14％的亚硫酸氢钠，用均浆机将精米研磨；将精米浆液过200目的尼龙网，将精米过滤后的浆液收集到离心瓶内；尼龙网用超纯水冲洗两次，将滤液与精米过滤后的浆液混合；3000r/min离心20min，倒掉上清；用超纯水再次悬浮淀粉后，3000r/min离心20min，倒掉上清；重复上一步3次；将淀粉晾干，结块后取出，放在55度烘箱快速烘干；将淀粉块用粉碎机粉碎，过200目筛子；干燥器保存。(2)直链淀粉含量的测定本实验通过在720nm处测定与碘反应的淀粉样品的吸光值来测定其中直链淀粉的含量。其中以土豆直链淀粉和玉米支链淀粉含量作为标准样品制作标准曲线，直链淀粉含量根据标准曲线获得。

热力学特性的测定：精确称取淀粉10mg于氧化铝坩埚中，加入30μl无菌水，密封氧化铝坩埚，室温平衡24h后，使用差示扫描量热仪对样品进行糊化特性测试。设置仪器以10℃/min的速度，由30℃升温至95℃，扫描热量变化。

粘度特性的测定：取一定量的米粉或淀粉样品于快速粘度仪专用的圆筒形铝盒，加入25mlddh2o，配成浓度为6％(以干基计)的米粉或淀粉乳。最初以960rpm的速度搅拌10s，然后减小到160rpm的速度旋转至测定结束。测定条件如下：50℃下保持1min，然后以12℃/min升温到95℃，在95℃保持2min，再以12℃/min速度降温到50℃，在50℃保持2min。

淀粉颗粒形貌和粒径大小分布的观察：用导电双面胶将淀粉粉末固定在金属样品平台，真空镀膜然后置于扫描电镜，以10kv电子束观察收集具有代表性的淀粉颗粒形貌照片。称取样品100-200mg于干净ep管中，加入1ml75％酒精，涡旋混匀后超声混匀。将混匀后的样品加入到mastersizer3000进行粒度分布测定，每样测定三次，收集数据。

晶体结构的测定：利用x-射线衍射测定(x-raydiffraction,xrd)分析淀粉的晶体结构，将不同品种的淀粉样品平铺到样品池上，然后置于xrd测试平台上。测定条件：钨灯λ＝0.15406nm，功率1600w(40kv×30ma)，扫描速率4°/min，扫描范围4-35°。使用软件jade5.0计算测定样品的相对结晶度。

水溶性指数和膨胀力的测定：称取淀粉100mg至于一玻璃试管内，向试管内加入10ml的超纯水，充分悬浮震荡，95℃水浴30分钟，每隔5分钟，充分震荡一次。试管冷却到室温之后，3000g离心20分钟，上清液倒入一次性培养皿中，剩下的固体胶状物，称量重量，记为ws。培养皿中的上清液置于100℃烘箱内，烘干至恒重，记为w1。膨胀力用sp表示，水溶性指数用wsi表示。计算公式如下：wsi＝w1/0.1×100％；sp＝ws/[0.1×(100％-wsi)](g/g)。

数据统计分析：所得测定结果采用其平均值±标准偏差的形式，采用spss24.0统计软件对所得结果进行方差分析，主成分分析和构建回归方程，差异显著性分析采用ducan法，p<0.05表示差异显著。并且利用sas软件对稻米淀粉理化指标进行pearson相关性分析。

2.2技术路线(如图2所示)

2.3可行性分析

本项目实验思路清晰；实验材料稳定，易于鉴定；技术路线成熟；已经有较好的实验基础；仪器设备齐全，实验条件完善；团队结构合理。各方面均能保障本实验工作的圆满完成。

2.3.1实验技术方案切实可行

本项目采用生产上常用高产、优质稻作为实验材料，实验其受灌浆期高温影响的机理，挖掘与水稻耐高温相关的淀粉关键生理指标，建立不同品种耐高温评价标准，对水稻育种家选育优质高产耐高温水稻品种具有重要意义。同时采用分期播种方式和温室控温实验相结合，可获得更加真实可靠、应用价值高的数据。

2.3.2实验基础良好

本发明已经完成2018年和2019年的田间分期播种实验，并于2020年完成温室控温实验。根据田间分期播种实验初步得到灌浆期高温可以使稻米淀粉理化特性变差，进而使蒸煮食味品质变劣。并于2020年利用人工气候室控温条件，得到灌浆期昼夜高温和灌浆期不同时段高温对稻米淀粉理化特性的影响，全面解析灌浆期高温对稻米淀粉理化特性影响的机理和明确耐高温水稻品种的淀粉形态和理化特征。同时结合分期播种和温室控温实验，筛选与耐高温关联密切的淀粉理化指标作为关键理化指标，并利用关键淀粉理化指标建立不同水稻品种耐高温评价标准。

2.3.3实验技术成熟、实验技术成熟

申请者及所在实验组长期从事水稻品质性状的遗传实验和稻米品质常规检测，积累了大量的种质资源和相关稻米品质分析技术，包括稻米品质的分析与鉴定，稻米淀粉理化特性和精细结构分析，稻米的消化特性分析等技术。另外，本项目借助于湖南杂交水稻实验中心杂交水稻国家重点实验室和水稻国家工程实验室等国家级科研平台，湖南杂交水稻实验中心具有设备齐全的稻米及制品质量检测平台，拥有良好的实验条件，实验设施较为齐全，有利于本发明的开展和最终顺利完成。

3、实验的基础和条件

3.1本发明申请者长期从事逆境胁迫对稻米品质影响的相关实验

申请人主要从事水稻高温低温盐碱胁迫生理机制，稻米品质检测分析等实验工作。发表期刊论文10篇，围绕本项目以第一作者撰写sci论文2篇(一篇1区sci论文已在线发表，另一篇正在投稿)，cscd核心期刊2篇，参与省级课题4项。

3.2项目组成员具有多年的稻米品质检测鉴定工作积累

项目参与人员沈泓多年来一直在湖南杂交水稻实验中心米质平台负责稻米品质检测服务，具备专业的稻米品质检测技术。

3.3发明直接相关的前期工作是本发明实施例顺利实施的基础

本发明已经于2018和2019年连续两年在长沙实验田对6个高产品种分3期和10期播种，筛选灌浆期处于高温和适温条件下的两个播期，并对6个实验材料在这两种温度条件下的加工品质、外观品质、直链淀粉含量、糊化特性做了测定和分析。具体实验结果如下：

3.3.1灌浆期高温和适温温度的变化情况，见表1和图3

根据前人实验结果，水稻灌浆期最适生长温度为22-27℃，本实验分析水稻抽穗后30天的平均日均温得到，在2018年分期播种中，除18q006外，第一播期为高温(ht)水平，第三播期为适温(ct)水平。由于18q006第一播期和第三播期的始穗后40天平均日均温都高于27℃，所以都视为ht(表和图未提供)。在2019年分期播种中，除19q006，筛选到第一播期、第六播期灌浆期都为高温，分别定义为ht1、ht2；第十播期为适温播期，定义为ct(表1和图3)。而19q006，以第六和第七播期分别为ht1和ht2，第十播期为ct。

表16个水稻品种3个播种期抽穗后30天的平均日均温

3.3.2高温对直链淀粉含量的影响

高温使其它品种的直链淀粉含量(aac)显著降低(表2)。高温对直链淀粉含量的影响，不同实验的观点不同，有实验认为高温使直链淀粉含量降低，而其它实验则认为高温使直链淀粉含量升高，还有实验认为高温对直链淀粉含量的影响因品种而异，其使含高直链淀粉的品种直链淀粉含量升高，含低直链淀粉的品种直链淀粉含量降低。本人认为这中实验结论的不一致可能是由于所选用的实验材料不一致的缘故。

表2高温对直链淀粉和糊化特性的影响

3.3.3高温对支链淀粉链长分布的影响

从图4可知，除了19q001，随着灌浆期温度的升高，短支链淀粉含量(dp6-18)显著降低，中等支链淀粉含量显著增加(dp21to33)，长支链淀粉含量(大于dp34)没有显著性变化。而对于19q001，短支链淀粉含量(dp6-10)显著下降，支链淀粉含量(dp11-20)显著增加，在超过dp21的支链淀粉含量就不再明显变化。因此，随着灌浆期温度的增加，短支链淀粉含量显著下降，中等支链淀粉含量显著增加，这可能与糊化温度的升高有关。

3.3.4高温对淀粉糊化特性的影响

糊化特性通常用糊化温度和糊化焓(δh)。糊化温度包括起始糊化温度(t0)、峰值糊化温度(tp)、终止糊化温度(tc)。本实验发现，高温可以显著性增加糊化温度(表2)，糊化温度反映了稻米蒸煮的难易程度，升高的糊化温度使蒸煮精米时需要更高的蒸煮温度和使蒸煮时间变长。除此之外，高温使糊化焓升高，这说明在蒸煮精米使需要更多的热量。糊化焓与直链淀粉含量负相关，所以糊化焓的升高，可能与直链淀粉含量的降低有关。

3.3.5关键淀粉理化指标的筛选

研究高温对六个水稻品种三个重复，三个播期共54块田的不同淀粉理化指标的影响进行综合分析，同时结合六个水稻品种不同播期间淀粉理化指标的变异系数，得到直链淀粉含量(aac)、垩白度(cha)、糊化焓(△h)、崩解值(bd)和消减值(sb)对高温环境更为敏感，被作为关键淀粉理化指标(如表3、表4)。

3.3.6六个水稻品种高温耐受性的综合评价

2019年，除19q006外，以第十播期为对照ct，以第一播期和第六播期分别为高温条件1和高温条件2，即ht1和ht2。实验分为两个高温对照组，即ht1/ct和ht2/ct。以五个与高温紧密关联的淀粉理化指标的高温胁迫指数为实验数据进行主成分分析，ht1/ct和ht2/ct两个实验组各得到三个主成分，每一个主成分看作一个综合指标，累计贡献率都达到95％以上，见表5。各主成分值、隶属函数值(ux)和高温综合评价值(d值)见表6。利用五个关键淀粉理化指标的高温胁迫指数为自变量，以耐高温综合评价值为因变量，做回归方程，得到各品种的高温耐受程度预测值(fv)，见表6。综合以上得到，各品种的高温耐受程度，从强到弱顺序为：黄华占、y两优957、泰优390、天优华占、中早39和y两优1号。

4、依托单位和参与单位具备的实验条件

本发明所在单位湖南杂交水稻实验中心拥有杂交水稻国家重点实验室和水稻国家工程实验室等国家级科研平台，另外中心具有设备齐全的稻米及制品质量检测平台，拥有良好的实验条件，实验设施较为齐全，有利于本课题的开展和最终顺利完成。

湖南杂交水稻实验中心拥有的与本实验相关的仪器包括：稻谷精米检测机(jgm8098)，高速粉碎机(ys-04)，日立全自动氨基酸分析仪(l-8090)，紫外-可见分光光度计(uv-1601pc)，快速粘度分析仪(rvasuper4)，快速水分测定仪(hr83-p)，马尔文激光粒度(mastersizer3000)，移液枪，恒温水浴锅，电子显微镜(philipsxl-3)，酶标仪，37℃恒温箱，hobo温光记录仪等。同时利用湖南省作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地的差示扫描量热(q2000)、x射线衍射仪(d8advance)等本实验所需仪器，互相补充，充分满足了该实验的分析测试仪器需求。

表3.ht1和ht2两种高温对灌浆期不同淀粉理化指标的影响

表4.2018年和2019年不同稻米品质理化指标在不同水稻品种和不同播期间的变异系数

表5.5个关键淀粉理化指标的经过主成分分析后得到的综合理化指标

表6.六个品种的各综合指标的主成分值，贡献率(wx),隶属函数值(ux)，综合评价值(d值)和回归方程预测值(fv)

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。