一种创制晚抽薹玉田包尖白菜的方法及其应用与流程

本发明涉及植物育种技术领域，尤其涉及一种创制晚抽薹玉田包尖白菜的方法及其应用。

背景技术：

大白菜(brassicarapal.ssp.pekinensis)为十字花科芸薹属作物，栽培历史悠久，种质资源丰富，是我国蔬菜栽培中种植面积最大、分布最广的蔬菜作物之一。传统的大白菜种植一般遵从立秋播种，立冬砍菜，北方地区可窖藏至来年春季食用。如春季种植，则幼苗在持续低温下易通过春化作用导致抽薹开花失去商品性。随着日本、韩国对大白菜晚抽薹性开展的育种改良，培育出可春季种植的晚抽薹大白菜品种，如：春夏王、强势、良庆等品种。晚抽薹大白菜的培育改变了大白菜的传统种植模式，实现了大白菜从春到秋，周年生产周年供应的新型栽培模式的迅速兴起，同时韩国、日本晚抽薹大白菜杂交种纷纷涌入我国，占据国内春白菜的主要市场。而我国由于传统的栽培模式，并未对春种晚抽薹大白菜进行育种的资源储备。

目前研究认为大白菜晚抽薹性为多基因控制的数量性状，易抽薹基因为部分显性，晚抽薹为隐性，因此筛选晚抽薹大白菜资源，利用传统的杂交分离、回交筛选，再纯化稳定，至少需要7-8年，这导致了目前的晚抽薹大白菜资源匮乏，类型单一，多为近年来韩国、日本合抱类型的晚抽薹大白菜占据国内春白菜的主要市场。

玉田包尖白菜原产于河北省玉田县，因其“外形优美、产量高、品质佳、抗性较强”而闻名全国。不同于传统叠抱、合抱或直筒类型的结球白菜，玉田包尖大白菜的主要特征是：外叶深绿色，叶柄、叶脉为绿色；叶球直筒拧抱，球顶部尖锐，球基部较粗，呈炮弹型或笋型，是结球白菜中的特殊类型。玉田包尖白菜独特的形状和上乘的品质，在秋冬季白菜市场具有极好的产业优势。

技术实现要素：

为了至少解决一种现有技术存在的技术问题，本发明提供一种创制晚抽薹玉田包尖白菜的方法及其应用。

第一方面，本发明提供一种创制晚抽薹玉田包尖白菜的方法，包括：

采用小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的玉田包尖大白菜和小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的晚抽薹大白菜进行杂交得到f1代；

对f1代进行游离小孢子培养得到再生植株，经出苗驯化、春化处理后选择自然加倍的双单倍体单株进行自交。

进一步地，在所述杂交前还包括：

筛选获得小孢子具有胚胎发生能力，且能诱导成胚的玉田包尖大白菜作为所述小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的玉田包尖大白菜；和/或，

筛选获得小孢子具有胚胎发生能力，且能诱导成胚的晚抽薹大白菜作为所述小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的晚抽薹大白菜。

由于晚抽薹大白菜和玉田包尖大白菜本身不属于小孢子容易被诱导胚胎发育生成胚状体的大白菜种类，本发明通过大量筛选，从晚抽薹大白菜和玉田包尖大白菜中筛选得到了小孢子被诱导启动胚胎发育生成胚状体能力较好的晚抽薹大白菜和玉田包尖大白菜品种，并进行杂交，杂交后发现其子代也具备小孢子易诱导形成胚状体的能力，并借此将小孢子培养引入大白菜育种资源创制，即以小孢子易诱导形成胚状体的玉田包尖大白菜和晚抽薹大白菜为亲本杂交得到小孢子易诱导形成胚状体的f1代，并且该f1代的小孢子具备易被诱导形成胚状体的能力，可以通过小孢子培养得到稳定的同时兼具玉田包尖和晚抽薹性状的大白菜dh系。

进一步地，所述小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的玉田包尖大白菜为塔青，和/或，所述小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的晚抽薹大白菜为金娃娃。

进一步地，所述对f1代进行游离小孢子培养得到再生植株为：

对f1代植株收集小孢子进行诱导得到胚状体，将所述胚状体转入改良b5固体培养基进行组织培养，经过多次继代培养得到再生植株；

所述改良b5固体培养基为在b5固体培养基的基础上还包含：6-苄氨基嘌呤(6-ba)1.5mg/l、α-萘乙酸(naa)0.05mg/l和蔗糖30g/l，ph值为5.8～6.0。

b5固体培养基是基本领域常规使用的培养基，具体成分可以参考gamborg,o.l.,etal.,1968，nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.exp.cellres.50,151-158.文献中公开的b5固体培养基的组成。本发明发现，经过改良后，该培养基更适于本发明大白菜f1代胚状体生长发育得到再生植株。

进一步地，所述组织培养的培养条件为：温度24～26℃，光照强度1000～1500lx，每天光照时间为12～16h。

进一步地，所述对f1代进行诱导得到胚状体为：

收集f1代大白菜的小孢子在33～35℃条件下热激暗培养24～28h，之后在25～26℃条件下继续暗培养，直至获得肉眼可见胚状体。

进一步地，所述诱导过程中使用nln-13培养基，nln-13培养基可以参考文献j.b.m.custers.2003.microsporecultureinrapeseed(brassicanapusl.)//m.maluszynskietal.(eds.),doubledhaploidproductionincropplants.publishedbykluweracademicpublishers,printedinthenetherlands:185-193.，在使用时添加蔗糖130.0g·l-1，调整溶液ph值为6.0，0.22μm针式过滤器过滤灭菌制得，4℃保存备用。

进一步地，所述f1代大白菜的小孢子为通过如下方法提取得到：

大白菜供体植株抽薹开花，选取长2～3mm，小孢子主要处于单核靠边期的花蕾；先用75％酒精浸泡30～40s，7％次氯酸钠溶液洗涤12～18min，无菌蒸馏水冲洗3～5遍；然后加入b5改良提取液，采用细胞破碎仪在3000r·min^-1条件下破碎10s，后进行小孢子的机械化提取和收集。

进一步地，所述出苗驯化为将所述再生植株定植于栽培基质中在25～26℃条件下覆膜驯化培养；和/或，所述春化为在每日晚19时至次日早7时之间加光照，光照强度1500-2000lx，处理30-40天，直至再生植株抽薹开花。

进一步地，所述自然加倍的双单倍体单株为通过如下方式选择得到：对所述再生植株进行倍性观察，选择株型正常，花器官正常，花粉充足，自交授粉结籽正常的再生植株即为自然加倍的双单倍体单株。

进一步地，在所述选择自然加倍的双单倍体单株进行自交之后，还包括对于自交后得到的种子进行田间鉴定，所述田间鉴定为：

当所述种子是于春季获得时，在秋季鉴定其抱合类型，选择具玉田包尖抱合性状的大白菜，在次年春季再次田间鉴定，筛选获得兼具晚抽薹和玉田包尖抱合性状的大白菜；

当所述种子是于秋季或冬季获得时，在次年春季直接筛选获得兼具晚抽薹和玉田包尖抱合性状的大白菜。

本发明进一步提供所述方法在提高培育同时具备晚抽薹和玉田包尖性状的大白菜的效率中的应用。

本发明具备如下有益效果：

本发明从不属于小孢子容易被诱导胚胎发育成胚状体的大白菜种类中筛选得到小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的玉田包尖大白菜和晚抽薹大白菜，在进行杂交后，其子代也具备小孢子易被诱导启动胚胎发育生成胚状体的能力，并借此将小孢子培养引入大白菜育种资源创制，并进一步通过小孢子培养得到稳定的同时兼具玉田包尖和晚抽薹性状的大白菜双单倍体植株(dh系)，极大缩短了育种进程至2年，使玉田包尖白菜实现春季种植，达到周年生产供应，同时对推动我国本土大白菜在春种市场的发展，丰富春季大白菜的品种类型具有极大的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1提供的创制晚抽薹玉田包尖白菜的技术路线；

图2为本发明实施例1提供的晚抽薹大白菜金娃娃的田间植株表型；

图3为本发明实施例1提供的晚抽薹大白菜金娃娃小孢子诱导胚状体情况；

图4为本发明实施例1提供的玉田包尖大白菜塔青的田间植株表型；

图5为本发明实施例1提供的玉田包尖大白菜塔青小孢子诱导胚状体情况；

图6为本发明实施例1提供的“金娃娃-塔青”f1小孢子诱导胚状体进行组培继代获再生植株；

图7为本发明实施例1提供的“金娃娃-塔青”f1小孢子胚状体再生植株于玻璃温室授粉结籽照片；

图8为本发明实施例1提供的“金娃娃-塔青”f1小孢子胚状体再生植株dh系群体田间鉴定；

图9为本发明实施例1筛选获得的兼具晚抽薹和玉田包尖特性的dh系单株春季筛选耐抽薹性与双亲的比较；

图10为本发明实施例1筛选获得的兼具晚抽薹和玉田包尖特性的dh系单株春、秋季的性状表现，其中，图中的左边大白菜为春季时的结球表现，右边大白菜为秋季时的性状表现；

图11为本发明实施例1提供的亲本塔青在秋季的田间表现。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例中，晚抽薹大白菜：金娃娃，为北京世农种苗有限公司产品。提取小孢子游离培养可诱导胚状体生成。

玉田包尖白菜：塔青，来自中国农业科学院蔬菜花卉研究所，为绿笋70大白菜亲本之一(绿笋70大白菜为2019年农业农村部非主要农作物登记品种，登记编号：gpd大白菜(2019)110120，可市购)。提取小孢子游离培养可诱导胚状体生成。(满足条件的玉田包尖大白菜均可)

实施例1

本实施例提供一种创制晚抽薹玉田包尖白菜的方法，流程如图1所示，具体如下：

(1)晚抽薹白菜“金娃娃”(表型如图2所示，小孢子诱导胚状体如图3所示)与玉田包尖白菜“塔青”(表型如图4所示，小孢子诱导胚状体如图5所示)杂交，正反交不限，获得聚合目标性状基因的f1种子，命名为“金娃娃-塔青”f1。因杂交双亲都可诱导游离小孢子培养获得胚状体，为本发明筛选出的白菜易诱导胚胎发生基因型，其杂交种“金娃娃-塔青”f1受基因型影响，提取的小孢子进行细胞悬浮培养，具有诱导启动胚状体生成能力。

(2)种植“金娃娃-塔青”f1直至抽薹开花，利用白菜游离小孢子培养技术开展单倍体细胞悬浮培养，诱导获得胚状体。具体步骤如下：

①选取长度2～3mm、小孢子主要处于单核靠边期的花蕾。用75％酒精浸泡30s，7％次氯酸钠溶液洗涤15min，无菌蒸馏水冲洗3遍；

②加入b5改良提取液(根据文献gamborg,o.l.,etal.,1968，nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.exp.cellres.50,151-158.中所述的b5培养基，添加蔗糖130.0g·l^-1，甘露醇80.0g·l^-1，然后调整溶液ph值为5.8-6.0制得。高压灭菌(121℃，15min)后，冷却备用。)，采用细胞破碎仪(tomyms-100r)在3000r·min^-1条件下破碎10s，进行小孢子的机械化提取和收集。收集的单核靠边期小孢子悬浮于nln-13液体培养基，血球计数板调整小孢子悬浮液浓度为10⁵个/ml；

③小孢子悬浮液33℃热激诱导24h，启动小孢子向胚状体发育，继续转入25℃暗培养，直至2周后观察到肉眼可见的胚状体。

(3)将“金娃娃-塔青”f1小孢子诱导生成的大量胚状体转入改良b5固体培养基(在b5固体培养基的基础上还包括：6-苄氨基嘌呤1.5mg/l、naa0.05mg/l和蔗糖30g/l，ph值为5.8～6.0。b5固体培养基的成分可参考gamborg,o.l.,etal.,1968，nutrientrequirementsofsuspensionculturesofsoybeanrootcells.exp.cellres.50,151-158.文献中公开的b5固体培养基的组成)，组培继代以获得具根、茎、叶的小孢子再生植株(图6)。

(4)“金娃娃-塔青”f1小孢子胚状体再生植株组培苗陆续出苗，于玻璃温室驯化。正常栽培管理，待再生植株生长具5片真叶后，进行春化处理：玻璃温室环境，每日晚19时至次日早7时加光照，光照时间12h，光照强度1500-2000lx。白天自然光，正常栽培管理。春化处理30-40天左右，“金娃娃-塔青”f1小孢子再生植株陆续诱导出发育的花薹，抽薹开花。

(5)对抽薹开花的“金娃娃-塔青”f1小孢子再生植株，进行直观的植株倍性调查，筛选花器官正常，花粉充足的dh单株进行蕾期人工自交授粉、结籽，陆续收获纯合的dh系单株种子(图7)。

(6)“金娃娃-塔青”f1小孢子再生植株dh系群体进行田间鉴定(图8)。春季或秋季种植，调查dh系群体单株结球期抱合类型，筛选具玉田包尖特性的大白菜dh系；春季田间种植，调查“金娃娃-塔青”f1小孢子dh系单株晚抽薹性。以金娃娃或市场主流晚抽薹春白菜为对照，结球期调查薹高，筛选兼具晚抽薹特性的玉田包尖大白菜dh系。

(7)田间鉴定筛选获得的聚合晚抽薹特性和玉田包尖特性的大白菜dh系(dh系与双亲的比较如图9所示，从中可以看出塔青在春季由于抽薹较早，无法获得叶球，不具商品性)，进行种子扩繁，作为春种晚抽薹白菜亲本资源的储备。以及进一步应用于晚抽薹玉田包尖杂交种的组合试配。

(8)利用本方法，经过2年或2年半时间，“金娃娃-塔青”f1小孢子再生植株创制获得一系列兼具晚抽薹的玉田包尖大白菜dh单株资源，相比常规传统白菜育种资源的纯化工作，极大缩短了育种周期。

(9)对比兼具晚抽薹的玉田包尖大白菜dh系和其母代得到如图10和图11所示的结果，兼具晚抽薹的玉田包尖大白菜dh系在春季和秋季田间表现如图10所示，塔青在秋季田间表现如图11所示，对比看来，金娃娃-塔青”dh系在结球类型和叶质特点上和塔青接近，并且同时具备春季晚抽薹的特性，实现玉田包尖类型白菜可春季种植，可周年供应的目标。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。