红细胞冻存方法及冻存的红细胞

本发明涉及红细胞保存技术领域，尤其涉及红细胞冻存方法及冻存的红细胞。

背景技术：

血液的低温保存是所有生物材料保存中应用最广泛也是最重要的一部分，对血液保存的研究对于军事医学和临床救治等方面有着重要的意义，尤其是人体红细胞的长期低温保存对人类社会具有重大意义，例如自然灾害应急输血、稀有血型输血及研究、军事储备等方面都对人体红细胞的保存有着极大的需求。因此，研究如何高效的长期保存红细胞具有重要意义。

目前，临床上最常用的红细胞保存方法主要包括：1)4℃下的短期保存；2)高浓度甘油下的慢速冷冻保存。前者保质期短，通常只能保存35～42天，并且极易受到污染，引起红细胞存储病变。后者虽然使用高甘油慢速冷冻法能将红细胞保存时间延长至几年甚至几十年，但甘油的浓度高达40％，且对细胞具有毒性作用，使用前需要繁琐的去甘油化洗涤过程。添加和去除甘油的过程会浪费大量的时间和精力，极有可能耽误紧急条件下对人体的治疗。

除了临床上常用的这两种方法以外，低浓度甘油快速冷冻法和冷冻干燥法也是目前红细胞保存研究中的热点。相较于慢速冷冻，快速冷冻法利用低于20％的甘油预处理红细胞，然后直接将红细胞悬浮液丢入-196℃的液氮中进行低温保存，操作不封闭，容易造成细菌污染。且红细胞解冻复温时需进行快速复温，复温时间长容易造成损伤。经过该方法保存的红细胞可以存储5～10年，甚至更长时间，而且红细胞的形态和功能保存较为良好。尽管如此，低浓度甘油快速冷冻保存法冻存的红细胞仍然无法直接回输，在使用前仍面临甘油去除操作复杂不易的问题。此外，目前已有研究中，红细胞冷冻干燥后的存活率仍然比较低，技术不够成熟，在实践中仍然面临着巨大的困难。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供红细胞冻存方法及冻存的红细胞，以期提高红细胞的回收率。

本发明提供的红细胞的冻存方法，包括：

配制海藻酸钠溶液作为壳溶液；配制氯化钙溶液作为交联剂；

将去白红细胞悬浮液与生理盐水混合，获得红细胞溶液；

将红细胞溶液与低温保护剂溶液混合，制得核溶液；

使壳溶液和核溶液通过双通道同轴针头进入交联剂，凝固后获得的纤维液氮冷冻后保存。

在本发明的方案中，低温保护剂能够降低溶液毒性、防止渗透压和冰晶对红细胞造成损伤。而本发明中，仅采用单一的低温保护剂，就可以实现对红细胞良好的保护。所述红细胞为人红细胞。

本发明中，所述低温保护剂为非渗透性保护剂。本发明实施例中，所述低温保护剂为海藻糖或甘油；一些实施例中，所述低温保护剂为海藻糖，所述低温保护剂溶液中海藻糖的浓度为5％(w/v)～30％(w/v)；一些具体实施例中，低温保护剂溶液中海藻糖的浓度为1.2mol/l。

一些实施例中，所述低温保护剂为甘油，所述低温保护剂溶液中，甘油的体积分数为5％～30％(w/v)；一些具体实施例中，所述低温保护剂溶液中，甘油的体积分数为10％。

根据本发明的实验结果，以甘油作为低温保护剂，效果不及以海藻糖。实验表明，以海藻糖作为低温保护剂能够实现对红细胞更好的保护，获得更高的细胞回收率。

本发明基于水凝胶封装技术和海藻糖预脱水技术设计了一种“核壳”结构的水凝胶纤维封装人红细胞快速冷冻保存的方案，本发明利用海藻酸钠溶液为外层壳溶液，将含有低温保护剂的红细胞悬浮液作为核溶液，将氯化钙溶液作为交联剂溶液。将核、壳溶液分别通过两个液体推进泵传输至一个双通道同轴针头内，在浸入交联剂溶液的针头出口处交联形成封装着红细胞的核壳水凝胶纤维。

在本发明中，所述壳溶液中海藻酸钠的浓度为0.5％～3％(w/v)；所述交联剂中氯化钙的浓度为0.01～0.5mol/l。一些实施例中，所述壳溶液中海藻酸钠的浓度为1.5％(w/v)；所述交联剂中氯化钙的浓度为0.15mol/l。

本发明中，所述去白红细胞悬浮液与生理盐水混合至红细胞压积为75％～85％。一些实施例中，所述混合至红细胞压积为80％。所述红细胞溶液与低温保护剂溶液混合的体积比为1:1。混合后，核溶液中红细胞压积为40％。核溶液中红细胞压积适宜，因此无需将红细胞稀释后再保存。

本发明中，红细胞溶液的制备方法包括：将去白红细胞悬浮液，加入生理盐水，摇匀后以2000g离心5min，去除上清液，重复以上步骤3次得到压积约为80％的红细胞溶液，置于4℃冰箱中备用。

本发明中，所述核溶液的制备方法包括，将压积约为80％的红细胞溶液与等体积的低温保护剂溶液混匀作为核溶液，室温下静置5分钟备用。

本发明中，所述壳溶液通过双通道同轴针头的流速为10～1000μl/min；所述核溶液通过双通道同轴针头的流速为10～1000μl/min。本发明实施例中，所述壳溶液通过双通道同轴针头的流速为200～800μl/min；所述核溶液通过双通道同轴针头的流速为200～800μl/min。

实验表明，核溶液和壳溶液的流速对冻存效果存在着显著影响。核溶液的流速大于壳溶液的流速不仅能够提高冻存纤维中红细胞的体积比，还能够提高冻存后红细胞的回收率。一些实施例中，所述壳溶液通过双通道同轴针头的流速为200～500μl/min；所述核溶液通过双通道同轴针头的流速为500～800μl/min。一些具体实施例中，所述壳溶液通过双通道同轴针头的流速为500μl/min；所述核溶液通过双通道同轴针头的流速为800μl/min。另一些具体实施例中，所述壳溶液通过双通道同轴针头的流速为200μl/min；所述核溶液通过双通道同轴针头的流速为500μl/min。

本发明中，所述双通道同轴针头的直径为1mm，制备所得纤维的直径为0.5～3mm，液氮冷冻的时间不低于20min。

本发明所述的冻存方法以低温保护剂对红细胞进行保护，以海藻酸钠形成的凝胶作为壳结构，将红细胞封装在纤维的内部。获得了良好的冻存效果，冻存后，红细胞的回收率较高。

本发明还提供了以所述冻存方法制得的含有红细胞的纤维。

本发明所述含有红细胞的纤维，以海藻酸钠交联形成的凝胶作为壳结构，包裹含有低温保护剂的红细胞溶液。

本发明还提供了以本发明所述冻存方法冻存的红细胞的解冻方法，其包括将所述含有红细胞的纤维以柠檬酸钠溶液浸泡，所述柠檬酸钠溶液的温度为37℃～45℃。解冻中，所述柠檬酸钠溶液的浓度为0.1mol/l～1mol/l。所述浸泡的时间为20～25秒。优选的，柠檬酸钠浸泡后，将纤维从柠檬酸钠溶液中取出，室温静置至纤维溶解。

本发明提供了一种核壳纤维封装人红细胞快速冷冻保存的方法。本发明所使用的红细胞低温保护剂为非渗透性保护剂，在其保护下，将红细胞包裹如海藻酸钠交联形成的凝胶壳结构中，形成含有红细胞的纤维。本发明提供的红细胞冷冻保存方案相比于现有的红细胞冻存技术，节省了繁琐的添加甘油和去甘油化过程，不仅可以使人红细胞在无甘油的快速冷冻保存中冻后存活率达90％以上，同时红细胞能够保持良好的显微形态。

附图说明

图1本发明实施例1制备的封装红细胞的核壳纤维结构示意图；

图2本发明实施例1制备的封装红细胞的核壳纤维的光学显微镜图。

具体实施方式

本发明提供了红细胞冻存方法及冻存的红细胞，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：以海藻糖为低温保护剂

1、实施方法：

1)溶液配制：海藻酸钠溶液浓度为1.5％(w/v)，氯化钙溶液为0.15m，柠檬酸钠溶液为0.8m。低温保护剂配方为：1.2m海藻糖溶液。

2)红细胞预处理：取适量去白红细胞悬浮液(在4℃冰箱内保存少于15天)，加入0.9％nacl溶液离心去除上清液，重复以上步骤3次得到压积约为80％的红细胞溶液。加入适量0.9％nacl溶液以获得25ml压积为40％的红细胞溶液，置于4℃冰箱中备用。

3)添加低温保护剂：取25ml上述预处理好的红细胞加入冻存管中，再加入等体积的低温保护剂混匀，在室温下静置5min。

4)生成水凝胶纤维以封装红细胞：以上述添加了保护剂的红细胞悬浮液为核溶液，海藻酸钠溶液为壳溶液，氯化钙溶液为交联剂，利用现有技术中已有的核壳结构水凝胶纤维生成技术对红细胞进行封装。先启动壳溶液注射泵，使得海藻酸钠溶液被挤出，几秒后启动核溶液注射泵，在浸入cacl2溶液中的针尖处形成核壳结构的水凝胶纤维。将生成的封装着红细胞的核壳结构的水凝胶微纤维收集至烧杯中，进行后续实验。通过调节推进泵的流速来调节所生成的核壳纤维的尺寸大小。

5)冷冻保存红细胞-水凝胶纤维：将纤维直接扔进液氮，冷冻至少20min。然后取出进行解冻，将纤维从液氮中取出后立即放入温热的柠檬酸钠溶液中，20～25秒后从水浴锅中取出在室温下静置5分钟待纤维完全溶解，得到红细胞悬浮液离心以备用。

6)计算红细胞冻后回收率：用分光光度计检测上述步骤5)中各组红细胞悬浮液离心后上清液在415nm处的吸光度值a。另取一组只添加了生理盐水的组作为阳性对照组a0，假定阳性对照组为0％溶血；再取一组添加了纯水且反复冻融3次的组作为阴性对照组a1，假定阴性对照组为100％溶血。通过以下公式计算出红细胞的冷冻回收率：

其中，0.6m海藻糖保护剂不同核溶液流速下，核壳结构的水凝胶纤维封装红细胞快速冷冻保存的冻后回收率(壳溶液流速统一为500μl/min)如表1所示，0.6m海藻糖保护剂不同壳溶液流速下，核壳结构的水凝胶纤维封装红细胞快速冷冻保存的冻后回收率(核速统一为500μl/min)如表2所示。各组实验各设5个重复。

表1

表2

结果显示，以海藻糖作为低温保护剂可获得良好保护效果，其中，当核溶液流速为500～800μl/min，壳溶液流速为200～500μl/min时，冻存红细胞的回收率最高，可达90.43％～94.51％。当核溶液流速为800μl/min，壳溶液流速为500μl/min的条件下红细胞回收率可达94.51％，显著优于其他各组条件下冻存效果，p<0.05。

实施例2：以甘油为低温保护剂

1、实施方法：

1)溶液配制：海藻酸钠溶液浓度为1.5％(w/v)，氯化钙溶液为0.15m，柠檬酸钠溶液为0.8m。低温保护剂配方为：10％(w/v)甘油。

2)红细胞预处理：取适量去白红细胞悬浮液(在4℃冰箱内保存少于15天)，加入0.9％nacl溶液离心去除上清液，重复以上步骤3次得到压积约为80％的红细胞溶液。加入适量0.9％nacl溶液以获得25ml压积为40％的红细胞溶液，置于4℃冰箱中备用。

3)添加低温保护剂：取25ml上述预处理好的红细胞加入冻存管中，再加入等体积得低温保护剂混匀，在室温下静置5min。

4)生成水凝胶纤维以封装红细胞：以上述添加了保护剂的红细胞悬浮液为核溶液，海藻酸钠溶液为壳溶液，氯化钙溶液为交联剂，利用现有技术中已有的核壳结构水凝胶纤维生成技术对红细胞进行封装。先启动壳溶液注射泵，使得海藻酸钠溶液被挤出，几秒后启动核溶液注射泵，在浸入cacl2溶液中的针尖处形成核壳结构的水凝胶纤维。将生成的封装着红细胞的核壳结构的水凝胶微纤维收集至烧杯中，进行后续实验。通过调节推进泵的流速来调节所生成的核壳纤维的尺寸大小。

5)冷冻保存红细胞-水凝胶纤维：将纤维直接扔进液氮，冷冻至少20min。然后取出进行解冻，将纤维从液氮中取出后立即放入温热的柠檬酸钠溶液中，20～25秒后从水浴锅中取出在室温下静置5分钟待纤维完全溶解。

6)计算红细胞冻后回收率：用分光光度计检测上述步骤5)中各组红细胞悬浮液离心后上清液在415nm处的吸光度值a。另取一组只添加了生理盐水的组作为阳性对照组a0，假定阳性对照组为0％溶血；再取一组添加了纯水且反复冻融3次的组作为阴性对照组a1，假定阴性对照组为100％溶血。通过以下公式计算出红细胞的冷冻回收率：

表35％甘油下，核壳结构的水凝胶纤维封装红细胞快速冷冻保存的冻后回收率(壳溶液流速统一为500μl/min)

结果表明，虽然以甘油作为低温保护剂也可以实现对红细胞的冻存，但冻存后红细胞回收率较低。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。