槟榔碱协同薄荷醇诱导形成条件性位置偏爱动物模型的方法及应用

本发明属于动物模型构建技术领域，具体涉及槟榔碱协同薄荷醇诱导形成条件性位置偏爱动物模型的方法及应用。

背景技术：

槟榔为棕榈科植物槟榔arecacatechul.的干燥成熟种子，主产于印度尼西亚、马来西亚及中国的广东、海南、广西和云南等地。随着槟榔产业的不断发展，槟榔不仅仅局限于药用，更多地被应用到食品产业中。据统计世界上约有6亿人嚼食槟榔，嚼食槟榔时能使人产生轻微的兴奋性和欣快感，同时缓解精神紧张达到提神的作用，而长期嚼食会导致一定的依赖性。而薄荷醇是用于槟榔制品产生清凉效果且药性不强的化学物质，其作为槟榔制品的重要添加剂，能掩盖槟榔苦涩味，使感觉清新，提高槟榔咀嚼的柔和性、降低口腔和喉部刺激，因此在槟榔制品工业化应用广泛，而薄荷醇的加入会进一步增强对槟榔的依赖性。槟榔依赖是一种以失去自我控制、强迫性反复用药为特征的慢性复发性脑疾病，符合世界卫生组织归纳的依赖行为特征。2003年世界卫生组织认定槟榔为一级致癌物，长期嚼食会增加口腔癌等多种肿瘤的患病风险。

条件性位置偏爱(conditionedplacepreference,cpp)动物行为学模型是临床前评价药物依赖潜力的主要方法之一。现有专利cn111165428a公开了一种嚼食槟榔成瘾的动物模型的构建方法及其应用，其主要是提取槟榔嚼块的提取液涂抹于饲料表面基于实验线束采食以用于评价实验动物嚼食槟榔成瘾的动物模型。然而根据目前的研究，已在槟榔中鉴定出了包括槟榔碱、槟榔次碱、异槟榔碱，去甲基槟榔碱等15种生物碱，因此仅以槟榔嚼块提取液构建动物模型无法明确其中具体是哪种物质诱导成瘾，不利于槟榔成瘾的神经生物学机制研究；并且以该方法构建得到的动物模型无法用于槟榔碱协同薄荷醇诱导依赖的神经生物学机制研究中，同时该模型的构建方法中槟榔嚼块提取液的制备步骤操作复杂且繁琐费时。

技术实现要素：

本发明基于目前尚缺乏理想的槟榔碱协同薄荷醇的cpp依赖模型的技术问题，从槟榔的多种有效成分中筛选得到了可构建cpp动物模型的槟榔碱，并将其与薄荷醇配合，进一步调节二者的给药量使其发挥协同增效作用，成功构建得到了一种cpp动物模型，该动物模型不仅可用于评价槟榔碱协同薄荷醇的依赖性，也更有利于进一步探索槟榔碱协同薄荷醇诱导依赖的神经生物学机制，并且该动物模型的构建方法简单省时、重复性好、无需联用其他药物。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

槟榔碱协同薄荷醇诱导形成条件性位置偏爱动物模型的方法，所述方法包括：将槟榔碱和薄荷醇依次给予限饲中的实验动物，接着进行条件性位置偏爱训练，训练结束后对所述实验动物进行检测，得到条件性位置偏爱动物模型；

其中所述槟榔碱和所述薄荷醇的给予量为：按照实验动物的体重给予槟榔碱0.03～0.1mg/kg，薄荷醇1mg/kg。

进一步的，所述槟榔碱和所述薄荷醇的给予量为：按照实验动物的体重给予槟榔碱0.03mg/kg，薄荷醇1mg/kg。

进一步的，所述槟榔碱和所述薄荷醇的给药方式为腹腔注射。

进一步的，所述槟榔碱和所述薄荷醇的给药间隔时间为5min。

进一步的，所述条件性位置偏爱训练具体为：每日上午依次皮下注射槟榔碱和薄荷醇，然后立刻将所述实验动物放置于伴药箱中45min，同时每日下午皮下注射生理盐水后将所述实验动物放置于非伴药箱中45min，其中上午和下午的间隔时间为6小时。

进一步的，所述条件性位置偏爱训练的重复时间为10天。

进一步的，所述检测的时间为15min。

进一步的，所述实验动物为c57bl/6小鼠。

本发明还提供了上述方法构建的动物模型在评价槟榔碱协同薄荷醇的依赖性中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明从槟榔的多种有效成分中筛选得到了可构建条件性位置偏爱(cpp)动物模型的槟榔碱，将其与薄荷醇配合，进一步调节二者的给药量使其发挥协同增效作用，成功构建得到了一种稳定且重现性好的cpp动物模型，该动物模型不仅可用于评价槟榔碱协同薄荷醇的依赖性，也适用于进一步探索槟榔碱协同薄荷醇诱导依赖的神经生物学机制，为开展早期干预及治疗提供理论依据。本发明所述的方法操作简单方便、无需联用其他药物、省时省力，适合实验室大规模广泛应用。

附图说明

图1为本发明实施例1中各组小鼠cpp训练前后在伴药箱的活动时间；

图2为本发明实施例2的各组小鼠cpp训练前后小鼠在伴药箱活动时间的得分cppscore；

其中vehicle为对照组，a0.1表示0.1mg/kg槟榔碱组，a0.1+m1表示0.1mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组，a0.03表示0.03mg/kg槟榔碱组，a0.03+m1表示0.3mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1槟榔碱协同薄荷醇诱导形成cpp动物模型的方法

本实施例通过对槟榔碱和薄荷醇的给药量进行摸索，使其发挥协同增效作用，进而构建得到了稳定且效果优异的条件性位置偏爱小鼠模型，具体如下：

实验动物：雄性c57bl/6小鼠，体重18-20g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：scxk(京)2016-0006，质量合格证号：no.no.1100112011022161。

饲喂方式：所有小鼠进行单笼限饲喂养，即为了维持小鼠体重将每日小鼠的进食量进行限制。每日实验结束1h后喂食，每日进食量(g)＝20g-小鼠实验结束1h后体重(g)。

给药方式：腹腔注射(i.p.)。

仪器：条件性位置偏爱(cpp)试验装置(xr-xt401，上海欣软信息科技有限公司)，该装置由两块中间隔板将箱体分割成三部分，分别为白箱、黑箱和中间区域。试验动物进入装置后，该装置顶部的摄像系统将监视其行为活动，并由计算机记录保存。

实验方法：实验过程主要分为预处理、训练和测试三个阶段，具体为：

(1)预处理阶段：实验前，将小鼠放于抽出隔板的cpp试验装置中自由活动，适应2d后，第3d进行小鼠位置偏爱测试。测试前将隔板抽出，小鼠放置于中间区域,记录小鼠在15min内在黑白箱中的活动时间，结果作为基线值。结果发现：自然状态下，>90％的小鼠偏爱黑箱，因此，将黑箱选为非伴药箱，白箱选为伴药箱，同时剔除掉在任一边活动时间>总时间65％，或者中间区域时间>总时间45％的小鼠。

(2)训练阶段：取合格的小鼠58只，随机分成5组，按照小鼠的实际体重给予不同剂量的槟榔碱或槟榔碱+薄荷醇，并根据槟榔碱和薄荷醇的注射剂量的差异，将小鼠分别设置为：对照组(槟榔碱和薄荷醇均为0mg/kg)、0.03mg/kg槟榔碱组、0.1mg/kg槟榔碱组、0.3mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组以及0.1mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组。其中对照组小鼠9只，0.03mg/kg槟榔碱组小鼠15只，0.1mg/kg槟榔碱组小鼠9只，0.3mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组小鼠15只，0.1mg/kg槟榔碱+1mg/kg薄荷醇组小鼠10只。

第4-13d，关闭隔板，每日上午将给药组小鼠腹腔注射不同剂量的槟榔碱或槟榔碱+薄荷醇(先注射槟榔碱，5min后再注射薄荷醇)后放置于伴药箱45min；下午注射与槟榔碱同体积的生理盐水后将小鼠放置于非伴药箱45min(其中对照组小鼠则上下午均注射生理盐水)；其中上下午间隔时间为6h。

(3)测试阶段：在第14d时，对上述经过训练阶段的小鼠进行测试，测试前将隔板抽出，所有小鼠不经过任何处理，放置于中间区域，记录小鼠在15min内在黑白箱中的活动时间，结果作为测试值。

数据处理：数据以mean±sem表示，用graphpadprism5软件进行数据统计分析与作图；同时采用单因素方差分析，分析比较各组小鼠在伴药箱中的活动时间；并计算训练前后小鼠在伴药箱活动时间的得分(cppscore)，计算公式为：cppscore(s)＝训练后小鼠在伴药箱的活动时间(s)-训练前小鼠在伴药箱的活动时间(s)，*p<0.05为显著性差异，**p<0.01为极显著性差异。

其中各组小鼠每日进入训练前的平均体重如表1所示。分别统计分析并比较各组小鼠在第3d(cpp训练前)和第14d(cpp训练后)在伴药箱中的活动时间(s)，以及在训练前后在伴药箱中活动时间的cppscore(s)，结果如图1和图2所示。其中vehicle表述对照组，a表示槟榔碱(arecoline)，m表示薄荷醇(menthol)。

表1各组小鼠每日进入训练前的平均体重

根据表1的结果，在整个实验过程中，小鼠的体重维持较均衡，均控制在18-20g，说明实验过程中的每日进食量控制较好。根据图1和图2的测定结果，其中相比于对照组，在槟榔碱0.01mg/kg～0.03mg/kg+薄荷醇1mg/kg的剂量下，小鼠cpp训练后在伴药箱活动的时间和cppscore均高于对照组，并且在槟榔碱0.03mg/kg+薄荷醇1mg/kg的剂量给药组小鼠，cpp训练后在伴药箱活动的时间和cppscore均极显著高于对照组，说明在槟榔碱0.03mg/kg+薄荷醇1mg/kg的给药剂量下，小鼠形成了效果较好的cpp模型，提示在该剂量下模型造模成功，且构建的cpp动物模型十分稳定，重现性好。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。