一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂

1.本发明涉及鱼类养殖技术领域，尤其是涉及一种野生异齿裂腹鱼 精液冷冻保护剂。


背景技术：

2.异齿裂腹鱼隶属于鲤形目,鲤科,裂腹鱼亚科,裂腹鱼属,俗称欧氏 弓鱼,副裂腹鱼,异齿弓鱼,地方名为棒棒鱼,是一种我国特有的高原冷 水性鱼种,分布于雅鲁藏布江中上游干支流及附属水体中。为了保护 野生异齿裂腹鱼，一方面是开展异齿裂腹鱼的养殖业，另一方面是需 要对野生异齿裂腹鱼进行保护，而对异齿裂腹鱼精液冷冻保存，不但 可以提高异齿裂腹鱼人工繁殖过程中的受精率，而且还有利于异齿裂 腹鱼的种质资源的保护。
3.相关研究表明，精液在冷冻平衡过程中，不可避免的通过呼吸代 谢产生大量的活性氧(ros),其所携带的氧自由基(o2‑
、h2o2和
‑
oh) 能使精子细胞膜的不饱和脂肪酸发生氧化，造成精子细胞膜损伤，最 终导致猪精子受精能力急剧下降。因此，在冷冻液中加入抗氧化成分 可以起到一定的保护作用。
4.荷叶提取物中主要含有黄酮类、生物碱类和鞣质类成分，黄酮类 物质是大多数氧自由基的清除剂，对治疗冠心病、高血压等疾病有显 著效果，并且有抗菌消炎的作用；荷叶提取物在较低的浓度下即可显 示出非常强的抗氧化能力。生物碱有降血脂作用、抗自由基、抑制高 胆固醇血症和动脉硬化等药疗、食疗功效，而且还有较强的抑菌效果。
5.绞股蓝又名七叶胆、甘茶蔓、七叶参，是葫芦科绞股蓝属植物。 绞股蓝主要有效成分之一为绞股蓝总皂甙，有80余种。绞股蓝有“南 方人参”之称，其总皂甙含量是人参总皂甙的四倍，具有降血脂，降 血压，坑疲劳，抗衰老，促生长，防癌抗癌等功效。绞股蓝主要有效 成分之二是绞股蓝多糖，它具有sod类似的活性，可清除超氧阴离 子(o2‑
)和羟基自由基(oh)，据最近有关研究证实，绞股蓝多糖可抑制 肿瘤细胞的增殖，绞股蓝多糖无任何毒副作用，且能对抗化疗药物引 起的骨髓抑制等不良反应，保护细胞免受自由基的攻击，对机体的免 疫机能有一定的增强作用，并有抗氧化、抗衰老等作用。
6.目前，鲜少有将荷叶提取物和绞股蓝多糖应用于鱼类精液的冷冻 保存上。所以，本研究通过大量反复试验和剂量冷冻筛选，发现了荷 叶提取物和绞股蓝多糖在鱼类精液冷冻保护中具有显著的效果。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明旨在提出一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂， 以提高对异齿裂腹鱼精液的保护，减少冷冻过程中的活性氧对精子的 损伤。
8.为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
9.一种野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂，由冷冻基础液、荷叶提取 物和绞股蓝多糖组成，所述荷叶提取物由包括如下步骤的方法制备得 到：
10.1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷 叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1
‑
2h；
11.2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5
‑
10加 入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3
‑
6h，同时进行超声处理；
12.3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：20
‑
30，常温下，超声处理6
‑
12h；
13.4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
14.5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5
‑
2:1混 合得到荷叶提取物。
15.进一步，所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数 比为90
‑
120:0.5
‑
1:0.05
‑
0.1。
16.进一步，所述冷冻基础液、荷叶提取物和绞股蓝多糖的重量份数 比为100:0.8:0.06。
17.进一步，每1000ml冷冻基础液中含有葡萄糖1
‑
1.5g、甘油5
‑
10ml、 柠檬酸1.2
‑
1.6g、甘氨酸0.3
‑
0.6g、咖啡因20
‑
50mg。
18.本发明还提供了一种如上述任一项所述的野生异齿裂腹鱼精液 冷冻保护剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
19.1)称取新鲜荷叶和干荷叶，并分别进行粉碎，将得到的新鲜荷 叶碎和干荷叶碎用纤维素酶预处理1
‑
2h；
20.2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:5
‑
10加 入到高浓度乙醇溶液中常温浸泡3
‑
6h，同时进行200
‑
300w超声处理；
21.3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：20
‑
30，常温下，200
‑
300w超声处理6
‑
12h；
22.4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
23.5)将新鲜荷叶提取物和干荷叶提取物按照重量份数比0.5
‑
2:1混 合得到荷叶提取物，并将荷叶提取物放置在0
‑
4℃储存备用；
24.6)将配方量葡萄糖、甘油、柠檬酸、甘氨酸、咖啡因溶于纯化 水中，得到冷冻基础液；之后向冷冻基础液中加入荷叶提取物和绞股 蓝多糖混匀，并使用0.2
‑
0.5μm的过滤器过滤得到冷冻保护剂；
25.7)将过滤得到的冷冻保护剂在低温环境下保存备用。
26.进一步，所述高浓度乙醇的质量浓度为90
‑
95％。
27.进一步，所述步骤3)中，超声处理之后进行过滤，向过滤后的 荷叶碎中添加质量浓度为20
‑
35％的乙醇溶液，料液比为1:20
‑
30，并 再次用超声处理3
‑
8h。
28.相对于现有技术，本发明所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂 具有以下优势：
29.本发明所述的野生异齿裂腹鱼精液冷冻保护剂同时添加荷叶提 取物和绞股蓝多糖的冷冻保护剂能够对异齿裂腹鱼精液起到很好的 保护作用，解冻后的精子活力基本保持为冷冻之前的活力，可能是荷 叶提取物和绞股蓝多糖在精液冷冻过程中减少了活性氧
对精子的损 伤，维持了精子的正常形态和功能，同时还提高冷冻精液的复苏率， 减少了冷冻对受精的影响。而且通过实验比较可知，虽然单独使用荷 叶提取物和绞股蓝多糖也能够保护精子，但其效果不够显著，只有当 荷叶提取物和绞股蓝多糖同时使用时，其对精液的保护效果最好，二 者之间存在协同作用，起到了相互促进的作用。通过实验组i
‑
v比较 可知，只有同时添加新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物对精子的保护效 果最好，新鲜荷叶与干荷叶中的成分有些许差异，导致了提取物中的 有效成分也会有差异，而且当新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物添加量 相当时，对精子的保护效果是最好的。
具体实施方式
30.需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例 中的特征可以相互组合。
31.下面将结合实施例来详细说明本发明。
32.实施例1荷叶提取物的制备
33.1)分别称取1000g新鲜荷叶和1000g干荷叶，并分别进行粉碎， 将得到的新鲜荷叶碎和干荷叶碎分别加入2倍重量的纯化水中，并加 入300g纤维素酶预处理1.5h，处理后将荷叶碎捞出；
34.2)分别将处理后的新鲜荷叶碎和干荷叶碎按照料液比1:10加入 到重量浓度为95％的乙醇溶液中常温浸泡4h，同时进行300w超声 处理；
35.3)之后分别向浸泡有新鲜荷叶碎和干荷叶碎的溶液中加入纯化 水，使料液比达到1：30，常温下，300w超声处理10h；
36.并在超声处理之后进行过滤，向过滤后的荷叶碎中添加质量浓度 为25％的乙醇溶液，料液比为1:30，并再次用超声处理5h；
37.4)将处理后的溶液浸提、减压浓缩后冻干，粉碎，得到新鲜荷 叶提取物和干荷叶提取物备用；
38.5)取3g新鲜荷叶提取物和5g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物a，取4g新鲜荷叶提取物和4g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物b，取5g新鲜荷叶提取物和3g干荷叶提取物混合后得到荷叶提 取物c，取8g新鲜荷叶提取物记为荷叶提取物d，取8g干荷叶提取 物记为荷叶提取物e，并将荷叶提取物a、b、c、d、e放置在4℃ 储存备用。
39.实施例2冷冻保护剂的制备
40.分别按照表1所示混合各组分，制备冷冻保护剂i、冷冻保护剂 ii、冷冻保护剂iii、冷冻保护剂iv、冷冻保护剂v、冷冻保护剂vi、 冷冻保护剂vii、冷冻保护剂viii。
41.其中，每1000ml冷冻基础液中含有葡萄糖1.25g、甘油10ml、 柠檬酸1.3g、甘氨酸0.45g、咖啡因25mg。
42.表1冷冻保护剂成分表
[0043][0044][0045]
发明人对该实施例的冷冻保护剂使用效果进行了如下试验：
[0046]
1、精液采集
[0047]
选择人工养殖的性腺发育成熟的雄性异齿裂腹鱼亲鱼，抓取雄鱼 放入干毛巾中，吸干体表水后，用手指挤压其腹部两侧，待精液流出 后，用经75％酒精消毒的胶头滴管地区精液。
[0048]
取2μl精液，加入15μl去离子水混匀置于载玻片上，盖上玻 片，用光学显微镜检测，只有能向前运动的精子被认为有活力(静止 在同一地方运动的则视为无活力)，以百分比来计算其能动性，测得 精子能动性为87.52％。
[0049]
2、精液冷冻储存
[0050]
取9个干净的2ml的冻存管，每个冻存管中加入0.5ml精液，其 中一个冻存管做空白对照组，什么也不加，其余8个冻存管作为实验 组i
‑
viii，分别加入1ml的冷冻保护剂i、冷冻保护剂ii、冷冻保护 剂iii、冷冻保护剂iv、冷冻保护剂v、冷冻保护剂vi、冷冻保护剂 vii和冷冻保护剂viii，并混匀。然后按照三步降温法进行冷冻保存， 即液氮罐顶部(
‑
15℃)停留2min，液氮面上约4cm处(约
‑
160℃) 停留5min，再直接投入液氮中保存。
[0051]
3、精子复苏
[0052]
解冻时，先将冻存管提至罐口，在液氮蒸汽中停留约2min，然 后将冻存管取出迅
速置于28℃水浴中解冻90s，取出置于室温下至完 全融化。
[0053]
4、精子激活后的活力检验
[0054]
室温条件下，取2μl解冻精液，加20μl人工养殖异齿裂腹鱼 的养殖水激活精子，同样在显微镜下检查精子活力，统计精子快速运 动时间，如表2。
[0055]
表2精子活力及快速运动时间
[0056][0057]
5、受精效果检验
[0058]
人工采集成熟异齿裂腹鱼卵子，分别使用实验组i
‑
viii解冻后的 精液与新鲜精液作为对照组，与刚采集的卵子进行人工受精，将受精 卵置于循环流水孵化系统进行孵化，统计受精率和孵化率。
[0059]
其方法是：将解冻后的精液用养殖水激活后即刻对卵子受精，受 精时间10min，用养殖水冲洗卵子并将沉卵和漂浮卵分离，将各组处 理中的浮卵分别计数500粒，分别移入容积为10000ml的玻璃钢内， 用控温仪控温11
‑
12℃孵化，连续微量充气流水孵化，3h后检查受精 率，210h后胚胎孵化出膜，统计孵化率，如表3。
[0060]
表3受精率及孵化率
[0061][0062]
从表2和表3可以看出，同时添加荷叶提取物和绞股蓝多糖的冷 冻保护剂能够对异齿裂腹鱼精液起到很好的保护作用，解冻后的精子 活力基本保持为冷冻之前的活力，可能是荷叶提取物和绞股蓝多糖在 精液冷冻过程中减少了活性氧对精子的损伤，维持了精子的正常形态 和功能，同时还提高冷冻精液的复苏率，减少了冷冻对受精的影响。 而且通过实验组i
‑
v与实验组vi
‑
vii比较可知，虽然单独使用荷叶 提取物和绞股蓝多糖也能够保护精子，但其效果不够显著，只有当荷 叶提取物和绞股蓝多糖同时使用时，其对精液的保护效果最好，二者 之间存在协同作用，起到了相互促进的作用。通过实验组i
‑
v比较可 知，只有同时添加新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物对精子的保护效果 最好，新鲜荷叶与干荷叶中的成分有些许差异，导致了提取物中的有 效成分也会有差异，而且当新鲜荷叶提取物与干荷叶提取物添加量相 当时，对精子的保护效果是最好的。
[0063]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明， 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等， 均应包含在本发明的保护范围之内。