具有苍白微种子的西瓜的制作方法

1.本发明涉及一起赋予西瓜植物以苍白微种子(microseed)表型的基因。此外，本发明涉及这些基因用于产生具有任选地微种子尺寸的苍白颜色种子的西瓜植物的用途，以及用于鉴定和选择具有苍白种子颜色的西瓜植物的方法和用于鉴定和选择具有微种子尺寸的西瓜植物的方法。


背景技术：

2.西瓜属于葫芦科(cucurbitaceae)的西瓜属(citrullus)。现代栽培的西瓜被称为栽培西瓜自交系(citrullus lanatus var.lanatus)(thunb.)matsum.&nakai。西瓜生长在世界热带和亚热带地区，主要用于食用其甜果肉。美国南部、中国、中东、非洲、印度、日本和南欧是最重要的西瓜产区。
3.栽培的西瓜植物是大型一年生植物，具有藤蔓状的生长习性。栽培的西瓜的成熟西瓜果实的果肉通常是红色的和甜的。栽培的西瓜的成熟果实的种子通常是深色(棕色至黑色)的并且是大的，使种子在红色果实果肉中明显。
4.消费者更喜欢无籽西瓜果实。出于这个原因，栽培的西瓜品种通常是三倍体。如果对三倍体西瓜植物授粉，则会触发果实发育。然而，这三组染色体使得成功的减数分裂非常不可能，并引起胚珠或胚在不产生成熟种子的情况下流产，这是种子败育的一个例子。尽管三倍体西瓜植物的果实被认为是无籽的，但它们确实含有这种夭折的不完全发育的种子。三倍体杂交品种是通过将四倍体母系与二倍体父系杂交而产生的。三倍体西瓜品种的种子生产和育种复杂且昂贵。由于三倍体植物没有可存活的花粉，因此西瓜种植者需要在生产区种植二倍体(授粉者)品种，以提供刺激果实形成的花粉。通常，每两到三排的三倍体西瓜种植一排的二倍体授粉者品种。授粉者品种和三倍体品种需要同步，以使授粉者在三倍体母体接受它们用于诱导坐果时产生花粉。很难做出好的组合，尤其是因为环境条件对授粉者和三倍体产生不同的影响，导致不同步和降低西瓜果实产量。通常选择容易区分的品种，以便将有籽的二倍体果实与无籽的三倍体果实分离，以便收获和销售。三倍体西瓜发芽较弱，比二倍体西瓜更难生长，并通常产生数量更少的果实。所有这些都使得三倍体西瓜果实的生产对西瓜种植者来说非常昂贵和复杂。对于种植者和消费者来说，果实中存在未发育种子的残留物可能是一个问题。尤其是在压力条件下，生产的果实带有明显突出的不完全发育的种子或甚至是消费者不喜欢的发育正常的种子的残留物。
5.因此，本发明的一个目的是避免使用三倍体西瓜果实生产。
6.在被子植物中，种子发育开始于双重受精。两个精子细胞中的一个与卵细胞融合形成二倍体合子，然后发育成具有芽分生组织、子叶、下胚轴、根和根分生组织的胚。另一个精子细胞使二倍体中央细胞受精以生成三倍体胚乳。在大多数双子叶植物如拟南芥(arabidopsis thaliana)中，胚乳最初生长迅速，但在发育后期被消耗。因此，胚占据了成熟种子的大部分。受精后，发育中的胚和胚乳周围的母体珠被经历细胞分化，可以积累色素、粘液和淀粉颗粒，并最终形成成熟种皮。
7.许多物种的种皮含有深色(棕色至黑色)色素。种皮着色已在拟南芥中得到最好的研究。在拟南芥种子中，在种子发育的后期观察到种皮的色素沉着。称为原花青素(pa)或缩合单宁的色素的实际合成开始于胚胎发育的早期阶段(受精后1-2天)。这些黄酮类化合物最初在内皮的液泡(珠被的最内层细胞层)中以无色化合物的形式积聚，并在种子干燥期间被氧化，从而赋予成熟种子以棕色。几种拟南芥种皮色素沉着突变体是已知的。在这些所谓的透明外种皮突变体中，拟南芥种皮呈现白色至淡黄色。许多透明外种皮基因编码黄酮类生物合成途径中的酶，而另一些则编码涉及该途径的几个点的调节基因。
8.种子的尺寸取决于胚、胚乳和母体组织的协调生长。植物种子生长到其物种特定尺寸主要由来自母体和合子组织的内部发育信号决定。已在拟南芥中鉴定出几种促进胚乳生长的基因。这些基因的功能丧失突变体形成小种子。这些突变体的表型由合子组织的基因型决定。相比之下，其他基因已被确定为母系地作用以调节种子尺寸。这些基因参与调节母体珠被中的细胞增殖和/或扩张。这些围绕胚珠的母体珠被在受精后形成种皮，并且被认为设置了种子尺寸的上限，因为它们为胚和胚乳的生长提供了腔。
9.在导致本发明的研究中，发现西瓜的多酚氧化酶基因(在本文缩写为ppo)中的修饰产生包含经修饰的ppo基因的植物具有苍白种子颜色的种子。此外，发现非功能性hookless1(hls1)基因和/或非功能性bcl-2associated anthanogene 4(bag4)导致包含所述一个或多个非功能性基因的植物具有微种子尺寸的种子。在西瓜植物中将经修饰的ppo基因与非功能性hls1基因和/或非功能性bag4基因组合产生新型西瓜植物，其产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子。这种西瓜植物产生的果实对消费者来说似乎是无籽的，没有三倍体西瓜果实生产和育种的所有缺点。
10.多酚氧化酶(ppo)是一种催化单酚羟基化成邻二酚(甲酚酶活性)和邻二酚氧化成邻醌(儿茶酚酶活性)的酶。虽然ppo催化的生化反应是众所周知的，但有关该酶的生理功能的数据却很少。这种酶几乎存在于所有植物中，也存在于真菌、细菌和动物中。大多数植物和真菌携带多个ppo型基因拷贝，它们的表达被认为是组织特异性和发育控制或应激诱导的。植物内的不同拷贝具有不同的表达谱，甚至它们的细胞定位也可能不同。植物ppo蛋白以引起邻醌的快速聚合以产生黑色、棕色或红色色素(多酚)而闻名，这些色素在通过擦伤或割伤而导致组织破坏时引起例如水果或蔬菜褐变。在一些植物中还提出了ppo在抵抗病原体和食草动物方面的功能。存在几种测量ppo酶活性的测定法。
11.西瓜基因组包含8个ppo型基因拷贝，它们全部串联排列在3号染色体上(西瓜(citrullus lanatus)97103chr3:5634000-5814000，参见guo等人，2013，the draft genome of watermelon(citrullus lanatus)and resequencing of 20 diverse accessions.nature genetics 45(1):51-58)。


技术实现要素：

12.本发明提供了经修饰的西瓜ppo基因，为上述8个基因拷贝之一，其野生型被鉴定为seq id no：1，编码seq id no：5的蛋白质，或其野生型编码与seq id no：5具有至少90％序列同一性的蛋白质，其中经修饰的ppo基因包含相对于野生型一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸，并且其中所述一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸导致不存在功能性ppo蛋白。
watermelon(citrullus lanatus)and resequencing of 20 diverse accessions.nature genetics 45(1):51-58)中，本发明的经修饰的ppo基因的所述野生型位于3号染色体上的位置5704673..5707416(-)处。seq id no：20提供了存在于正链上的ppo基因的反向互补序列。术语“本发明的ppo基因的野生型”还包括按优先增加的顺序与seq id no：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
21.本发明的ppo基因的野生型编码seq id no：5的蛋白质。该野生型ppo蛋白质包含以下保守结构域：酪氨酸酶结构域(seq id no：5的aa 171-378，pfam结构域pf00264)、ppo1-dwl结构域(seq id no：5的aa 384-432，pfam结构域pf12142)，ppo1-kfdv结构域(seq id no：5的aa 458-585，pfam结构域pf12143)。术语“本发明的ppo基因的野生型”还包括编码蛋白质的基因，该蛋白质按优先增加的顺序与seq id no：5具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
22.本发明的经修饰的ppo基因包含相对于野生型一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸，并且所述一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸导致不存在功能性ppo蛋白。在本发明的上下文中，术语“不存在功能性ppo蛋白”是指不表达ppo蛋白，或者表达的ppo蛋白是非功能性的并且不具有ppo酶活性。对ppo基因的修饰可导致不存在ppo rna或显著降低的ppo rna水平，从而导致不存在ppo蛋白。可替代地，经修饰的ppo蛋白被表达但是是非功能性的：不存在ppo蛋白的一个或多个功能性结构域导致经修饰的ppo蛋白不能执行其作为多酚氧化酶的功能。不存在功能性ppo蛋白可以例如通过使用ppo酶活性测定法来确定。简而言之，在这种测定法中，蛋白质提取物由种皮组织制成，之后可以将不同的酚类底物添加到该蛋白质提取物中，并且可以通过使用分光光度计测量颜色变化来确定ppo活性的显著降低(一般而言参见，例如rocha等人，1998，characterisation of 'starking'apple polyphenoloxidase.journal of the science of food and agriculture 77(4):527-534)。一种甚至更简单的方法是将整个种皮或种子放在酚类底物中并检查颜色变化，如chen等人所述(2014,fine-mapping and candidate gene analysis of black hull1 in rice(oryza sativa l.).plant omics,7(1):12-18)。
23.在一个实施方案中，本发明的经修饰的ppo基因包含导致不存在功能性ppo蛋白的提前终止密码子。在另一个实施方案中，本发明的经修饰的ppo基因包含提前终止密码子，导致ppo1-kfdv结构域不存在于编码的经修饰的ppo蛋白，ppo1-kfdv和ppo1-dwl结构域不存在于编码的经修饰的ppo蛋白，或ppo1-kfdv、ppo1-dwl和酪氨酸酶结构域不存在于编码的经修饰的ppo蛋白。在一个优选的实施方案中，相对于野生型在本发明的经修饰的ppo基因中一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸位于seq id no：1的位置1至712处，产生提前终止密码子，其导致不存在功能性蛋白质。在一个最优选的实施方案中，经修饰的ppo基因包含在seq id no：1的核苷酸711和712之间的t的插入(711_712inst)。
24.在以保藏号ncimb 43364保藏的西瓜植物的代表性种子的基因组中，存在对应于cl_97103_v1_chr3:5706705的基因组位置处a的插入(guo等人，同上)。该插入导致移码，这导致在seq id no：1的ppo基因(该基因在反向链上的基因组中)中引入提前终止密码子。seq id no：20提供了存在于正链上的ppo基因的反向互补序列。经修饰的ppo基因包含在seq id no：1的核苷酸711和712之间的t的插入。这一碱基对插入导致移码，这导致13个氨基酸被编码在错误的框中，随后是在经修饰的ppo基因的位置751-753处的提前终止密码子
(seq id no：2)。野生型ppo蛋白的尺寸为587个氨基酸(seq id no：5)，而经修饰的ppo蛋白(seq id no：6)，如果完全产生，只有250个氨基酸长，仅包含它的酪氨酸酶结构域的一小部分，完全缺乏其保守的ppo1-dwl和ppo1-kfdv结构域，并且在其c末端包含13个改变的氨基酸。因此突变蛋白是非功能性的。
25.本发明的经修饰的ppo基因纯合地存在时赋予植物以苍白种子颜色。
26.在一个实施方案中，本发明的经修饰的ppo基因是核酸，特别是核酸分子，更特别是分离的核酸分子。
27.种子颜色可以目测确定。虽然未携带本发明的经修饰的ppo基因的栽培西瓜植物的完全发育和成熟的干燥西瓜种子的颜色通常根据品种从中等棕色到黑色不等，但是纯合地携带本发明的经修饰的ppo基因的栽培西瓜植物的完全发育和成熟的干燥种子可以表示为米色、浅黄色、淡黄色、小麦色或浅卡其色。新鲜湿种子干燥后种子颜色几乎没有变化，与它们存在于成熟的西瓜果实中时一样。因此，纯合地携带本发明的经修饰的ppo基因的栽培西瓜植物的完全发育和成熟的新鲜种子的种子颜色可以表示为米色、浅黄色、淡黄色、小麦色或浅卡其色。当比较纯合地携带本发明的经修饰的ppo基因的本发明植物产生的种子的颜色和杂合地携带或根本不携带经修饰的ppo基因的同基因植物的种子的颜色时，所有种子必须处于相同的发育阶段并且所有种子必须全部新鲜或全部干燥。
28.植物育种者和种植者经常使用rhs颜色图表(the royal horticultural society,london,uk)来目测确定植物颜色，但明显也可以使用其他颜色图表或系统来确定颜色。例如，颜色也可以使用munsell颜色系统以rgb颜色代码来指示，或者可以使用色度计或图像分析来确定。本领域技术人员知道如何使用这些不同的颜色系统并在不同颜色系统之间转换颜色代码。
29.种子的颜色也可以通过使用色度计或通过使用图像分析来确定，例如，如在实施例1中所描述的。当确定种子的颜色时，最好对每个种子批次的适当数量的种子(例如至少10个种子)进行此操作，以便可以计算平均颜色值。对于图像分析，需要以标准化设置拍摄照片。重要的是要拍摄的大约10个种子彼此清晰地分开，并且为了以后对照片进行颜色校正，最好在每张照片中包含一个颜色图表，例如x-rite色卡护照颜色图表(colorchecker passport colorchart)。通过使用cellprofiler管道或类似程序对颜色校正的照片进行图像分析，可以生成校准的rgb值。然后可以使用颜色校准算法将这些转换为例如cielab l*a*b*颜色值。
30.广泛用于测量颜色(例如使用色度计或图像分析)的颜色量表是cielab颜色量表。该量表包括3个数据变量：l*、a*和b*。l*表示0到100标度的亮度，其中0为黑色，100为白色。变量a*和b*表示红色、绿色、蓝色和黄色的量：a*值表示从绿色(负值)到红色(正值)的颜色变化，而b*表示从黄色(正值)到蓝色(负值)的颜色变化。两个样品之间的颜色差异可以用l*和/或a*和/或b*的变化来表示。
31.由纯合地携带本发明的经修饰的ppo基因的植物产生的种子具有苍白种子颜色。如本文所用，术语“苍白种子颜色”旨在表示完全发育和成熟的干燥种子的种子颜色，其是米色、浅黄色、淡黄色或浅卡其色和/或完全发育和成熟的干燥种子具有使用图像分析确定的l*(10
°
/d65)分数，例如如上文或实施例1中所描述的，按优先增加的顺序至少为55、60、62、64、66、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、80、85、90。当使用图像分析对所述植物的
干燥成熟种子进行测定时，l*(10
°
/d65)分数合适地不高于99。
32.本发明种子的苍白种子颜色表型是由于种皮(也称为外种皮)中棕色色素的减少或不存在。本发明的苍白颜色种子的种皮具有减少量的棕色色素，这些棕色色素通常存在于由不纯合地包含本发明的经修饰的ppo基因的植物产生的成熟种子阶段的种子的种皮中。特别地，本发明种子的种皮具有如此少量的棕色色素，以致本发明的所述植物种子的种皮中的棕色是肉眼无法检测到的。更具体地，本发明种子的种皮完全缺乏棕色或黑色种子的种皮中通常存在的棕色色素。
33.种皮是种子的外保护层，来源于胚珠的珠被。因此种皮是母系起源的。因此，种子的颜色取决于产生种子的植物(在杂交中接受花粉的亲本植物)的基因型。由于该性状是隐性的，因此产生种子的西瓜植物(亲本植物)需要纯合地包含本发明的经修饰的ppo基因以产生苍白种子。在杂交中提供花粉的父本植物的基因型对该授粉后亲本植物产生的种子的颜色没有影响。
34.本发明涉及包含本发明的经修饰的ppo基因的西瓜植物，其中经修饰的ppo基因的纯合存在赋予植物以苍白种子颜色。本发明的经修饰的ppo基因可以包含在栽培西瓜自交系植物的基因组中，该栽培西瓜自交系植物的代表性种子以保藏号ncimb 43364进行保藏。植物可以杂合地包含本发明的经修饰的ppo基因，在这种情况下，由该植物产生的种子不具有苍白种子颜色性状，但该植物可用于将本发明的经修饰的ppo基因转移到另一植物。植物还可以纯合地包含本发明的经修饰的ppo基因，在这种情况下，所述植物产生具有苍白种子颜色的种子。
35.本发明还涉及包含本发明的经修饰的ppo基因的西瓜植物，其中植物还包含非功能性hls1基因，所述hls1基因的野生型被鉴定为编码seq id no：9的蛋白质的seq id no：7，或所述hls1基因的野生型编码与seq id no：9具有至少90％序列同一性的蛋白质，和/或非功能性bag4基因，所述bag4基因的野生型被鉴定为编码seq id no：12的蛋白质的seq id no：10，或所述bag4基因的野生型编码与seq id no：12具有至少90％序列同一性的蛋白质，其中不存在功能性hls1蛋白和/或不存在功能性bag4蛋白质赋予植物以微种子尺寸。
36.本发明的西瓜hls1基因的野生型包含seq id no：7。在西瓜(citrullus lanatus)cv.97103的公众可获得的基因组组装中(版本1，参见guo等人，同上)，所述野生型hls1基因位于2号染色体上的位置29904246..29906227(-)处。本发明的hls1基因的术语野生型还包括这样的基因，其按优先增加的顺序与seq id no：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
37.本发明的西瓜hls1基因的野生型编码seq id no：9的蛋白质。该野生型hls1蛋白包含以下保守结构域：乙酰转移酶(gnat)家族结构域(seq id no：9的aa 38-146，pfam结构域pfam00583)。该hls1基因是n-乙酰转移酶家族基因，其编码催化乙酰基转移至底物的酶。拟南芥hls1基因与黄化和乙烯处理下顶端钩形成的调节有关，并显示参与糖和生长素信号传导。拟南芥hls1基因显示通过组蛋白乙酰化起作用(liao等人，2016,arabidopsis hookless1 regulates responses to pathogens and abscisic acid through interaction with med18 and acetylation of wrky33 and abi5 chromatin.the plant cell,28(7):1662-1681)。术语“本发明的hls1基因的野生型”还包括编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质按优先增加的顺序与seq id no：9具有至少90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
38.本发明的非功能性hls1基因可以包含相对于野生型一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸，导致不存在功能性hls1蛋白。在这种情况下，不存在功能性hls1蛋白可能是由于不存在hls1 rna，导致不存在hls1蛋白。不存在功能性hls1蛋白也可能意味着不存在hls1蛋白的功能结构域，导致经修饰的hls1蛋白无法执行其功能。本发明的hls1基因也可以是非功能性的，因为它不存在于基因组中。
39.在一个实施方案中，本发明的非功能性hls1基因是核酸，特别是核酸分子，更特别是分离的核酸分子。
40.本发明的西瓜bag4基因的野生型包含seq id no：10。在西瓜(citrullus lanatus)cv.97103的公众可获得的基因组组装中(版本1，参见guo等人，同上)，所述野生型bag4基因位于2号染色体上的位置29911929..29915565(+)处。术语“本发明的bag4基因的野生型”还包括这样的基因，其按优先增加的顺序与seq id no：10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
41.本发明的西瓜bag4基因的野生型编码seq id no：12的蛋白质。该野生型bag4蛋白包含以下保守结构域：泛素样结构域(seq id no：12的aa 49-117，interpro结构域ipr000626)和bag结构域(seq id no：12的aa 141-219，interpro结构域ipr003103)。bag4基因编码的蛋白质是bag1相关蛋白家族的成员。bag1是一种抗凋亡蛋白，通过与多种细胞凋亡和生长相关蛋白的相互作用发挥作用。术语“本发明的bag4基因的野生型”还包括编码这样的蛋白质的基因，该蛋白质按优先增加的顺序与seq id no：12具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。
42.本发明的非功能性bag4基因可以包含相对于野生型一个或多个被取代、插入和/或缺失的核苷酸，导致不存在功能性bag4蛋白。在这种情况下，不存在功能性bag4蛋白可能是由于不存在bag4 rna，导致不存在bag4蛋白。不存在功能性bag4蛋白也可能意味着不存在bag4蛋白的一个或多个或所有功能结构域，导致经修饰的bag4蛋白不能执行其功能。本发明的bag4基因也可以是非功能性的，因为它不存在于基因组中。
43.在一个实施方案中，本发明的非功能性bag4基因是核酸，特别是核酸分子，更特别是分离的核酸分子。
44.本发明的西瓜植物可以杂合地包含非功能性hls1基因和/或非功能性bag4基因。优选地，本发明的西瓜植物纯合地包含非功能性hls1基因和/或纯合性地包含非功能性bag4基因并且该植物产生具有微种子尺寸的种子。如果hls1基因和/或bag4基因不存在于基因组中，则这种不存在优选地也是纯合的，这意味着两个拷贝都不存在。
45.本发明进一步涉及西瓜植物，其包含本发明的经修饰的ppo基因，进一步包含在2号染色体上对应于在西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组上碱基对位置29902114和29916077之间被缺失的13962bp的缺失，其中该缺失纯合地存在时赋予植物以微种子尺寸。通过这种缺失，从西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组的2号染色体上位置29902115处的g开始到西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组的2号染色体上位置29916076处的a的所有核苷酸都已被缺失。序列seq id no：13提供了从2号染色体的位置29897185到29920517的cl_97103_v1基因组序列。赋予微种子尺寸的基因组缺失对应于seq id no：13的碱基对位置4930和18893之间的所有核苷酸的缺失。这种基因组缺失导致两个基因被缺
失：seq id no：7的hls1基因和seq id no：10的bag4基因。优选地，该缺失包含在栽培西瓜自交系植物的基因组中，该栽培西瓜自交系植物的代表性种子以保藏号ncimb 43364进行保藏。这种缺失可以杂合地存在，在这种情况下，由植物产生的种子不具有微种子尺寸性状，但植物可用于将本发明的这种缺失转移到另一种植物。优选地，这种缺失纯合地存在并且植物产生具有微种子尺寸的种子。
46.不存在功能性hls1蛋白和/或不存在功能性bag4蛋白赋予西瓜植物以微种子尺寸。
47.种子尺寸可由技术人员目测估计，但使用图像分析或使用卡尺进行测量更好，如实施例1中所描述的。当确定种子的尺寸时，这必须在适当数量的完全发育和成熟的干燥种子上进行，例如每个种子批次至少有10个种子，这样就可以计算出平均尺寸。使用卡尺可以测量种子长度、种子宽度和种子厚度。种子长度是对于西瓜种子尺寸的最佳测量。
48.以保藏号43364保藏在ncimb的具有苍白颜色和微种子尺寸的种子具有4.0mm的平均长度、2.5mm的平均宽度和1.5mm的平均厚度。保藏的种子的平均100个种子重量(100sdw，以g为单位)为0.7g。一般来说，种子长度和100sdw之间存在很强的相关性。
49.如本文所用，术语“微种子尺寸”意指当在约10个种子上进行测定时，完全发育和成熟的干燥种子具有以优先增加的顺序平均长度最多为6.0mm、5.9mm、5.8mm、5.7mm、5.5mm、5.4mm、5.3mm、5.2mm、5.1mm、5.0mm、4.9mm、4.8mm、4.7mm、4.6mm、4.5mm、4.4mm、4.3mm、4.2mm、4.1mm、4.0mm、3.9mm、3.8mm、3.7mm、3.6mm、3.5mm、3.0mm、2.5mm或2.1mm。种子长度合适地不低于2.0mm。
50.如本文所用，术语“本发明的西瓜植物”或“本发明的植物”意指包含本发明的经修饰的ppo基因并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的西瓜(栽培西瓜自交系)植物。包含本发明的经修饰的ppo基因并且进一步包含在2号染色体上对应于在西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组上碱基对位置29902114和29916077之间被缺失的13962bp的缺失的西瓜植物也是本发明的植物，在该植物中hls1基因和bag4基因两者不存在于基因组中。优选地，在本发明的植物中，所述缺失包含在栽培西瓜自交系植物的基因组中，所述栽培西瓜自交系植物的代表性种子以保藏号ncimb 43364进行保藏。
51.本发明的西瓜植物可以是任何类型、任何果实形式或果实颜色的西瓜植物，并且优选地为农艺优良的西瓜植物。在一个实施方案中，本发明的西瓜植物的成熟果实具有红色、橙色或黄色果肉。在另一个实施方案中，所述植物的成熟果实的果肉具有可溶性固形物，按优先增加的顺序至少为5.0白利糖度、6.0白利糖度、7.0白利糖度、8.0白利糖度、9.0白利糖度、9.5白利糖度、10.0白利糖度、10.5白利糖度、11.0白利糖度、11.5白利糖度、12.0白利糖度、12.5白利糖度、13.0白利糖度、13.5白利糖度、14.0白利糖度、14.5白利糖度、15.0白利糖度、15.5白利糖度、16.0白利糖度或17.0白利糖度。所述植物的成熟果实的可溶性固形物合适地不高于18白利糖度。在另一个实施方案中，本发明的西瓜植物是近交系植物或杂交植物。在又一个实施方案中，本发明的西瓜植物是二倍体、四倍体或三倍体植物。
52.在三倍体西瓜植物纯合地包含本发明的经修饰的ppo基因并且任选地进一步纯合地包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的情况下，这些植物在通过二倍体授粉者授粉后产生的果实相对于不含本发明的一个或多个基因的三倍体西
瓜植物是改善的。与正常三倍体果实相比，可存在于此类果实中的未完全发育的种子或偶尔正常发育的种子由于苍白颜色和任选地尺寸更小而较不明显。
53.在本发明的上下文中，“农艺优良西瓜”植物是具有产生可区分和理想的农艺性状积累的基因型的植物，其允许生产者收获具有商业意义的产品。
54.如本文所用，“近交系的植物”是三轮或更多轮自交或回交产生的植物群体中的植物，或者该植物是双单倍体。近交系可以例如是用于产生商业杂交种的亲本系。
55.如本文所用，“杂交植物”是具有不同基因型的两种不同植物之间杂交产生的植物。更具体地，杂交植物是两种不同近交系植物之间杂交的结果，使得杂交植物可以例如是f1杂交品种的植物。
56.本发明还包括西瓜种子，其包含本发明的经修饰的ppo基因，其中从所述种子生长的植物由于经修饰的ppo基因的纯合存在而产生具有苍白种子颜色的种子，并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因，其中不存在功能性hls1蛋白和/或不存在功能性bag4蛋白赋予从所述种子生长的植物以微种子尺寸。
57.本发明进一步涉及本发明的西瓜植物的部分，其包含本发明植物的果实或本发明植物的种子，其中所述植物部分包含本发明的经修饰的ppo基因，并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因。
58.本发明还涉及由本发明的西瓜植物产生的西瓜果实，其中所述西瓜果实的种子具有苍白种子颜色并且任选地具有微种子尺寸。这种西瓜果实是本发明的果实。
59.此外，本发明还涉及包含本发明的果实或其部分的食品或加工食品。食品可能已经经历了一个或多个加工步骤。这样的加工步骤可以包括但不限于以下任何一种处理或其组合：去皮、切割、洗涤、榨汁、烹饪、冷却或制备包含本发明的果实的沙拉混合物。获得的加工形式也是本发明的一部分，因为它包含其中存在经修饰的ppo基因和/或非功能性hls1基因和/或非功能性bag4基因的dna。
60.本发明还涉及本发明植物的细胞。这样的细胞可以是分离形式或者是完整植物的部分或其多个部分，并且仍然构成本发明的细胞，因为这样的细胞具有赋予本发明的植物以苍白种子颜色和任选地微种子尺寸的遗传信息。本发明的植物的每个细胞都携带导致本发明的苍白种子颜色和任选地微种子尺寸的遗传信息。本发明的细胞也可以是可再生的细胞，其可以再生为本发明的新植物。如本文所用，遗传信息的存在是本发明的经修饰的ppo基因的存在和任选地本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的存在，或如本文定义的2号染色体上的缺失的存在。
61.本发明还涉及本发明植物的植物组织，其包含本发明的经修饰的ppo基因，并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因。组织可以是未分化的组织或已经分化的组织。未分化组织是例如茎尖、花药、花瓣或花粉，并且可以用于微繁殖以获得长成本发明的新植物的幼苗。该组织也可以从本发明的细胞生长。
62.此外，本发明还涉及本发明的植物、细胞、组织或种子的后代，该后代包含本发明的经修饰的ppo基因，并且任选地还包含本发明的非功能性hls1基因，和/或本发明的非功能性bag4基因。这样的后代本身可以是植物、细胞、组织或种子。后代尤其可以是以ncimb保藏号43364进行保藏的本发明植物的后代。如本文所用，“后代”意指来自与本发明植物杂交的第一代和所有其他后裔，其中杂交包含与自身的杂交或与另一植物的杂交，并且其中确
定为后代的后裔包含本发明的经修饰的ppo基因，并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因。后代还包括通过无性繁殖或其他形式的繁殖获得的材料。优选地，后代植物产生的种子由于本发明的经修饰的ppo基因的纯合存在而具有苍白种子颜色，并且任选地由于本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的存在，或如本文定义的2号染色体上的缺失的存在而具有微种子尺寸。
63.本发明还涉及能够发育成和/或衍生自本发明的植物的繁殖材料，其中所述繁殖材料包含本发明的经修饰的ppo基因，并且任选地进一步包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因，并且其中所述繁殖材料选自小孢子、花粉、子房、胚珠、胚、胚囊、卵细胞、插条、根、根尖、下胚轴、子叶、茎、叶、花、花药、种子、分生细胞、原生质体和其细胞或组织培养物。
64.本发明还涉及本发明的经修饰的ppo基因在产生植物中的用途，所述植物产生具有苍白种子颜色的种子。产生具有苍白种子颜色的种子的植物可以通过将经修饰的ppo基因引入其基因组来产生，特别是通过诱变或渐渗，或其组合。所述植物的种子可以具有微种子尺寸。
65.本发明还涉及本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因在产生植物中的用途，所述植物产生具有微种子尺寸的种子。产生具有微种子尺寸的种子的植物可以通过将本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因引入其基因组来产生，特别是通过诱变或渐渗，或其组合。从基因组中缺失hls1基因和/或bag4基因也可以导致本发明的hls1基因和/或本发明的bag4基因是非功能性的。所述植物的种子可能具有苍白颜色。
66.本发明还涉及本发明的植物在产生具有种子的西瓜果实中的用途，所述种子具有苍白种子颜色并且任选地具有微种子尺寸。
67.本发明还涉及用于鉴定经修饰的ppo基因的标志物，其中标志物序列检测在seq id no：1的核苷酸711和712之间的t的插入。该插入对应于在位置cl_97103_v1_chr3:5706705处a的单核苷酸插入。这种标志物的一个实例是标志物cl08381(seq id no：14和seq id no：15)。seq id no：15代表标志物cl08381的等位基因，其存在于包含本发明的经修饰的ppo基因的植物基因组中。seq id no：14代表该相同标志物的野生型等位基因，其存在于不包含本发明的经修饰的ppo基因的植物基因组中。标志物cl08381的两个标志物等位基因之间不同的核苷酸在下表4中用下划线和粗体表示。经修饰的ppo基因的标志物等位基因(seq id no：15)具有a的单核苷酸插入，其在表2中用下划线和粗体表示(seq id no：15的位置101)。
68.将该标志物用于鉴定和/或选择产生具有苍白种子颜色的种子的西瓜植物也是本发明的部分。本发明还涉及用于选择产生具有苍白种子颜色的种子的西瓜植物的方法，包括鉴定ppo基因中修饰的存在，任选地检查植物产生的种子的颜色，以及选择纯合地包含所述修饰的植物作为产生具有苍白种子颜色的种子的植物。可以通过使用如上定义的标志物来执行对ppo基因中修饰的存在的鉴定。
69.本发明还涉及用于鉴定2号染色体上的缺失的标志物，其中所述标志物序列检测对应于在seq id no：13的碱基对位置4930和18893之间被缺失的13962bp的缺失的存在或不存在。用于鉴定和/或选择产生具有微种子尺寸的种子的西瓜植物的这种标志物的用途
也是本发明的一部分。本发明还包括用于选择产生具有微种子尺寸的种子的西瓜植物的方法，包括使用如上定义的标志物鉴定2号染色体上的缺失的存在，任选地检查植物产生的种子的尺寸，和选择纯合地包含所述缺失的植物作为产生具有微种子尺寸的种子的植物。
70.用于检测缺失存在的标志物的实例是标志物cl_chr2_gap1，其引物为seq id no：16加seq id no：17(参见表4)。在包含基因组缺失的材料中，所述引物扩增446bp的pcr产物，在没有所述基因组缺失的材料中，这些引物不扩增pcr产物。用于检测不存在缺失的标志物的实例是标志物cl_chr2_gap2，其引物为seq id no：18加seq id no：19(参见表4)。在不包含基因组缺失的材料中，所述引物扩增945bp的pcr产物，在包含所述基因组缺失的材料中，这些引物不扩增pcr产物。
71.本发明还包括用于鉴定导致微种子尺寸的基因组缺失的存在的方法，其中所述方法包括以下步骤：
72.a)使用由seq id no：16加seq id no：17和/或seq id no：18加seq id no：19表示的引物运行测定法以确定seq id no：16和seq id no：17的扩增产物和/或seq id no：18和seq id no：19的扩增产物的存在；
73.b)通过指定以下确定缺失的存在：当产生由seq id no：16表示的引物和由seq id no：17表示的引物的产物时，存在缺失，并且当产生由seq id no：18表示的引物和由seq id no：19表示的引物的产物时，不存在缺失。
74.本发明还涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子颜色的种子，所述方法包括修饰本发明的ppo基因的野生型，其中修饰导致不存在功能性ppo蛋白，并且不存在功能性ppo蛋白导致所产生的植物的种子具有苍白种子颜色。本发明的ppo基因的野生型是按优先增加的顺序与seq id no：1具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因。任选地，其中ppo基因被修饰的植物具有微种子尺寸的种子。
75.本发明还涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有微种子尺寸的种子，所述方法包括修饰本发明的hls1基因的野生型和/或本发明的bag4基因的野生型，其中修饰导致植物中不存在功能性hls1蛋白和/或不存在功能性bag4蛋白，这导致由所述植物产生的种子具有微种子尺寸。本发明的hls1基因的野生型是按优先增加的顺序与seq id no：7具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因。本发明的bag4基因的野生型是按优先增加的顺序与seq id no：10具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的基因。在一个实施方案中，修饰是hls1基因和/或bag4基因的缺失。任选地，其中hls1基因和/或bag4基因被修饰的植物具有苍白种子颜色的种子。
76.本发明还涉及经修饰的核酸分子，其野生型被鉴定为seq id no：13，或其野生型与seq id no：13具有至少90％序列同一性，其中经修饰的核酸分子不包含seq id no：7和/或seq id no：10，其中经修饰的核酸纯合地存在时赋予西瓜植物以微种子尺寸。在一个实施方案中，该核酸分子包含对应于在seq id no：13的碱基对位置4930和18893之间被缺失的13962bp的缺失。
77.此外，本发明涉及所述经修饰的核酸分子在产生西瓜植物中的用途，所述西瓜植物产生具有微种子尺寸的种子。产生具有微种子尺寸的种子的西瓜植物可以通过将经修饰
的核酸分子引入其基因组中来产生，特别是通过诱变或渐渗，或其组合。
78.本发明涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子颜色的种子，所述方法包括：
79.a)将包含本发明的经修饰的ppo基因的植物与不包含所述经修饰的ppo基因的植物杂交；
80.b)任选地执行一轮或多轮自交和/或杂交由步骤a)产生的植物以获得下一代群体；
81.c)从群体中选择纯合地包含经修饰的ppo基因的植物，所述植物产生具有苍白种子颜色的种子。
82.本发明还涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子，所述方法包括：
83.a)将包含本发明的经修饰的ppo基因和包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物与不包含所述经修饰的ppo基因、非功能性hls1基因和非功能性bag4基因的植物杂交；
84.b)任选地执行一轮或多轮自交和/或杂交由步骤a)产生的植物以获得下一代群体；
85.c)从群体中选择纯合地包含经修饰的ppo基因和纯合地包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物，其产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子。
86.本发明还涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子，所述方法包括：
87.a)将包含本发明的经修饰的ppo基因的植物与包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物杂交；
88.b)任选地执行一轮或多轮自交和/或杂交由步骤a)产生的植物以获得下一代群体；
89.c)从群体中选择纯合地包含经修饰的ppo基因和纯合地包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物，其产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子。
90.本发明涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子颜色的种子，所述方法包括：
91.a)将包含本发明的经修饰的ppo基因的植物与不包含所述经修饰的ppo基因的植物杂交；
92.b)将由步骤a)产生的植物与不包含经修饰的ppo基因的亲本回交至少三代；
93.c)从第三或更高回交群体中选择纯合地包含经修饰的ppo基因的植物，所述植物产生具有苍白种子颜色的种子。
94.本发明还涉及用于产生西瓜植物的方法，所述西瓜植物产生具有苍白种子和微种子尺寸的种子，所述方法包括：
95.a)将包含本发明的经修饰的ppo基因并包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物与不包含所述经修饰的ppo基因、非功能性hls1基因和非
功能性bag4基因的植物杂交；
96.b)将由步骤a)产生的植物与不包含所述经修饰的ppo基因、非功能性hls1基因和非功能性bag4基因的植物回交至少三代；
97.c)从第三或更高回交群体中选择纯合地包含经修饰的ppo基因和纯合地包含本发明的非功能性hls1基因和/或本发明的非功能性bag4基因的植物，其产生具有苍白种子颜色和微种子尺寸的种子。
98.可使用本领域技术人员已知的常规方法例如rt-pcr、pcr、基于抗体的测定法、测序和基因分型测定法或其组合来检测导致苍白种子颜色的经修饰的ppo基因和/或经修饰的ppo蛋白的存在。此类方法可用于确定例如植物材料或植物部分中野生型ppo基因表达的降低，野生型ppo蛋白表达的降低，编码经修饰的ppo蛋白的经修饰的mrna、cdna或基因组dna的存在，或经修饰的ppo蛋白的存在，或者从其衍生的dna或rna或蛋白质。使用相同的常规方法，可以检测导致微种子尺寸的非功能性bag4和/或hls1基因和/或经修饰的bag4和/或hls1蛋白的存在。
99.野生型ppo基因、野生型bag4和/或野生型hls1基因的修饰或突变可以通过一种或多种化合物和/或通过物理方法和/或通过插入遗传元件随机引入，所述化合物例如甲磺酸乙酯(ems)、亚硝基甲基脲、羟胺、二氨基吖啶(proflavine)、n-甲基-n-亚硝基胍、n-乙基-n-亚硝基脲、n-甲基-n-硝基-亚硝基胍、硫酸二乙酯、乙烯亚胺、叠氮化钠、福尔马林、氨基甲酸酯、苯酚和环氧乙烷，所述物理方法例如uv照射、快中子暴露、x射线、伽马照射，所述遗传元件例如转座子、t-dna、逆转录病毒元件。
100.诱变还包括通过同源重组、基于寡核苷酸的突变引入、锌指核酸酶(zfn)、转录激活因子样效应子核酸酶(talen)或成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)系统来更特异地、靶向地引入至少一种修饰。
101.修饰野生型ppo基因、野生型bag4和/或野生型hls1基因还可以包括靶向基因组编辑的步骤，其中野生型ppo基因、野生型bag4和/或野生型hls1基因的序列被修饰，或其中野生型ppo基因、野生型bag4和/或野生型hls1基因分别被另一种被修饰的ppo、bag4或hls1基因取代。这可以通过本领域已知的用于修饰植物基因组中的dna的任何方法或通过基因取代的方法来实现。这样的方法包括基因组编辑技术和同源重组。
102.同源重组允许将核酸构建体靶向插入基因组中，并且靶向基于靶向整合位点侧翼的独特序列的存在。例如，ppo基因的野生型基因座可以被包含经修饰的ppo基因的核酸构建体取代，bag4基因的野生型基因座可以被包含经修饰的bag4基因的核酸构建体取代，和/或hls1基因的野生型基因座可以被包含经修饰的hls1基因的核酸构建体取代。
103.修饰野生型ppo、野生型bag4和/或野生型hls1基因可涉及使用锌指核酸酶(zfn)、tal(转录激活因子样)效应子核酸酶(talen)、成簇的规则间隔短回文重复序列/crispr相关核酸酶(crispr/cas核酸酶)，或经过工程改造以在植物、另一种生物体或宿主细胞的基因组中的特定识别序列处产生双链断裂的归巢核酸内切酶在dna中诱导双链断裂。
104.tal效应子核酸酶(talen)可用于在植物基因组中的特定识别序列处产生双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因取代。tal效应子核酸酶是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物体基因组中的特定靶序列处产生双链断裂。tal效应子核酸酶是通过将天然或工程改造的转录激活因子样(tal)效应子或其功能部分与核酸内切酶的催
化结构域(例如fok i)融合而产生的。独特的模块化tal效应子dna结合结构域允许设计具有潜在任何给定dna识别特异性的蛋白质。因此，可以对tal效应子核酸酶的dna结合结构域进行工程改造以识别特定的dna靶位点，并因此用于在所需的靶序列处产生双链断裂。
105.zfn可用于在植物基因组中的特定识别序列处产生双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因取代。锌指核酸酶(zfn)是一种融合蛋白，其包含负责dna切割的fok i限制性核酸内切酶蛋白的一部分和识别特定的设计的基因组序列并在这些序列处切割双链dna从而产生游离dna末端的锌指蛋白(urnov等人，2010，nat.rev.genet.11：636-46；carroll，2011，genetics 188：773-82)。
106.crispr/cas核酸酶系统还可用于在植物基因组中的特定识别序列处产生双链断裂，以通过同源重组进行基因修饰或基因取代。crispr/cas核酸酶系统是一种rna指导的dna核酸内切酶系统，在与设计的rna同源的dna片段中执行序列特异性双链断裂。可以设计序列的特异性(jinek等人,2012,science 337:816-821；cho等人,2013,nat.biotechnol.31:230-232；cong等人,2013,science 339:819-823；mali等人,2013,science 339:823-826；feng等人,2013,cell res.23:1229
–
1232)。cas9是一种rna指导的核酸内切酶，其具有在体外和体内以及真核细胞中在dna中产生双链断裂的能力。它是细菌和古细菌中rna介导的适应性防御系统的一部分，称为成簇的规则间隔短回文重复序列(crispr)。cas9与指导rna分子缔合时，cas9获得序列特异性，指导rna分子可以根据其序列靶向存在于生物体dna中的序列。cas9需要在指导rna靶向的dna序列之后紧接着存在前间区序列邻近基序(pam)。cas9酶首先是从化脓性链球菌(streptococcus pyogenes)中分离出来的(spcas9)，但已经报道了来自许多其他细菌物种的功能同源物，例如脑膜炎奈瑟菌(neisseria meningitides)、齿垢密螺旋体(treponema denticola)、嗜热链球菌(streptococcus thermophilus)、新弗朗西斯菌(francisella novicida)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)等。对于spcas9，pam序列是5
’‑
ngg-3’，而来自其他细菌的各种cas9蛋白已被证明识别不同的pam序列。在自然界中，指导rna是crrna和tracrrna之间的双链体，但包含crrna和tracrrna两者的单个指导rna(sgrna)分子已显示同样有效(jinek等人，2012，science 337：816-821)。使用sgrna的优势在于它将crispr-cas9系统的复杂性降低到两个组件，而不是三个。对于在实验装置(体外或体内)中的使用，这是一个重要的简化。
107.例如，cas9的替代物是cpf1，它不需要tracrrna来发挥作用，它识别不同的pam序列，并且它在dna中产生粘性末端切割，而cas9产生平末端。
108.一方面，可以应用遗传修饰技术在真核细胞中表达位点特异性核酸酶，例如rna指导的核酸内切酶和/或指导rna。可以通过稳定转化(其中dna构建体整合到基因组中)或通过瞬时表达(其中dna构建体未整合到基因组中，但它以瞬时方式表达rna指导的核酸内切酶和至少一种指导rna)，将一种或多种编码rna指导的核酸内切酶的dna构建体和至少一种指导rna引入细胞或生物体中。这种方法需要使用转化载体和合适的启动子以在所述细胞或生物体中表达。已经引入了外源dna的生物被认为是转基因生物(gmo)，这同样适用于从其衍生的细胞和这些生物的后代。在全球食品市场的重要部分，转基因食品是不允许人类食用的，也不受公众赞赏。然而，也有替代的“无dna”递送方法将crispr-cas组件递送到完整植物中，不涉及将dna构建体引入细胞或生物体中。
109.例如，已经描述了从编码rna指导的核酸内切酶的dna构建体体外转录编码cas9的mrna与至少一种指导rna后，将所述mrna引入细胞或生物体。这种方法不需要使用转化载体和合适的启动子来在所述细胞或生物体中表达。
110.另一种已知方法是核糖核蛋白(rnp)复合物的体外组装，包括rna指导的核酸内切酶蛋白(例如cas9)和至少一种指导rna，随后将rnp复合物引入细胞或生物体中。在植物中，rnp的使用已在原生质体中得到证实，例如用聚乙二醇(peg)转染(woo等人，2015，nat.biotech.33:1162-1164)。在基因组序列的所述修饰发生后，使用本领域已知的任何植物再生方法(例如体外组织培养)，原生质体或细胞可用于产生在其基因组中具有所述修饰的植物。
111.使用位点特异性核酸酶(例如本文上述的那些)破坏dna可以增加断裂区域中的同源重组率。因此，如上所述的这种效应子与核酸酶的偶联使得能够在基因组中产生靶向变化，包括添加、缺失和其他修饰。
112.本发明将在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅用于说明目的，并不旨在以任何方式限制本发明。在说明书和实施例中，参考了以下附图。
附图说明
113.图1：西瓜(栽培西瓜自交系)植物的成熟果实，其对于经修饰的ppo基因和2号染色体上对应于西瓜(citrullus lanatus)97103_v1上碱基对位置29902114和29916077之间被缺失的13962bp的缺失是纯合的，并且具有红色的果肉和苍白颜色微种子。
114.图2：以保藏号43364保藏在ncimb的种子，具有苍白颜色和微种子尺寸(左)，以及野生型西瓜品种的种子是黑色并且具有大种子尺寸(右)。尺寸条表示1厘米的尺寸。
115.保藏信息
116.西瓜(栽培西瓜自交系)种子对于包含在seq id no：1的核苷酸711和712之间的t的插入(711_712inst)的经修饰的ppo基因和2号染色体上对应于西瓜(citrullus lanatus)97103_v1上的碱基对位置29902114和29916077之间被缺失的13962bp的缺失是纯合的，其于2019年2月27日以保藏号ncimb 43364保藏在ncimb ltd,ferguson building,craibstone estate,bucksburn,aberdeen ab21 9ya,uk。
117.保藏的种子不符合获得植物品种保护所需的dus标准，并因此不能被视为植物品种。
实施例
118.实施例1
119.种子颜色的表型分析
120.在对具有浅色种子颜色的种子的西瓜植物的内部rijk zwaan种质资源库进行筛选时，选择了两种产生苍白颜色种子的黏籽西瓜(citrullus mucosospermus)种质(rz907-03和rz907-04)。在完全发育、成熟和干燥的种子上目测检查种子的颜色。所选择的两种黏籽西瓜种质的完全发育、成熟和干燥的种子的颜色可以表示为苍白、米色、浅黄色、淡黄色或浅卡其色。
121.还使用图像分析检查了所选择的两种种质的干燥种子的种子颜色。本次摄影是在
暗室的标准化设置中使用尼康d7000相机和尼康af-s 35mm f/1.8g dx 35mm镜头和圆形b+w偏振滤光器进行的。标准化相机设置使用带有偏振滤光器的日光荧光灯(4x36瓦，5400k，cri 98，40khz)。灯头与样品平台成45度角。在拍照之前，打开灯并让其预热至少30分钟。相机安装在支架上，镜头朝下并位于样品平台上方。为每个样品拍摄了大约10个明显彼此分开的种子。每张照片都包含x-rite色卡护照颜色图表。
122.使用imagej宏(1.48u)和x-rite色卡护照颜色图表对照片进行颜色校正。使用cellprofiler管道进行图像分析并生成校准的rgb值。然后使用颜色校准算法将校准的rgb颜色值转换为cielab l*a*b*颜色值(d65光源和10度观察角)。
123.表2列出了针对所选择的具有苍白种子颜色的黏籽西瓜种质和两个具有深色种子的栽培西瓜自交系种质的完全发育、成熟和干燥的种子所确定的平均校准的rgb值和校准的cie l*a*b*值(10
°
/d65)。
124.l*(10
°
/d65)值表示以0到100标度的亮度，其中0为黑色，100为白色。从表2可以清楚地看出，l*值最清楚地显示了苍白和深色种子之间的颜色差异：对于所选择的两个黏籽西瓜种质的苍白种子，平均l*(10
°
/d65)值为66.10和72.20；而棕色栽培西瓜自交系种质的平均l*(10
°
/d65)值为46.50，黑色栽培西瓜自交系种质为34.70。
125.表2：具有苍白种子颜色的所选择的黏籽西瓜种质和具有深色种子的两个栽培西瓜自交系种质的完全发育、成熟和干燥种子的校准的rgb值和校准的cie l*a*b*值(10
°
/d65)的平均颜色，如通过图像分析所确定的。
[0126][0127]
实施例2
[0128]
种子尺寸的表型分析
[0129]
在筛选具有小种子尺寸的种子的西瓜植物中，选择产生具有微种子尺寸的种子的两个栽培西瓜自交系种质。完全发育、成熟和干燥的种子的尺寸最初是通过目测观察和通过确定100sdw(一批100个种子的重量)来评估的。栽培西瓜自交系种质rz907-01的100sdw平均为0.8g(标准偏差0.3)，而栽培西瓜自交系种质rz907-02的100sdw平均为0.6g(标准偏差0.1)。具有微种子的两个栽培西瓜自交系种质的种子的100sdw和具有中等或大种子的三个对照种质的100sdw如表3所示。
[0130]
通过用精密天平称重并用卡尺测量来检查所选择的两种种质和具有中等或大种子的对照种质的完全发育、成熟和干燥的种子的种子尺寸。对于每种种质，称重和测量3到10批种子，并计算平均100sdw和种子尺寸。
[0131]
所确定的平均100sdw和种子尺寸见表3。
[0132]
表3：具有微种子尺寸的所选择的栽培西瓜自交系种质和三个具有中等或大种子的种质的完全发育的成熟的干燥种子的100个种子的平均重量(100sdw)和平均种子尺寸，如通过目测、用精密天平称重并用卡尺测量所确定的。
[0133][0134]
实施例3
[0135]
苍白种子颜色和微种子尺寸的qtl作图和基因鉴定
[0136]
开发了四个作图群体，以对负责苍白种子性状的基因组区域和负责微种子尺寸性状的基因组区域两者进行作图。
[0137]
用于对负责苍白种子性状的基因组区域进行作图的第一个作图群体是由具有正常种子尺寸、具有苍白颜色种子的黏籽西瓜植物(rz907-04)与具有中等种子尺寸的棕色种子的栽培西瓜自交系植物(giong)之间的杂交产生的。直到f5代，培育了182个ril品系，以对负责苍白种子颜色的基因组区域进行作图。通过图像分析对由这些f5植物产生的种子的颜色进行表型分析，而使用168个标志物对f5植物进行基因分型，其中104个为作图构建提供信息。
[0138]
两个作图种群是由具有正常种子尺寸、具有苍白颜色种子的黏籽西瓜植物(rz907-03)与具有深色微种子的栽培西瓜自交系植物(rz907-01)之间的杂交产生的。f2群体用于苍白种子颜色和微种子尺寸性状两者的初始qtl作图。对于qtl的精细作图和验证，通过使用栽培西瓜自交系植物(rz907-01)作为轮回回交(bc)亲本从f2植物中培育出近等基因系(nil)。对亲本系、f2群体(155个个体，用137个信息标志物进行基因分型)和bc3f3 nil群体(182个信息个体，用136个信息标志物进行基因分型)进行种子颜色和种子尺寸的表型分析，并对遗传图谱构建进行基因分型。
[0139]
对于qtl的精细作图和验证，将来自黏籽西瓜植物(rz907-04)和栽培西瓜自交系植物(giong)之间的杂交的苍白种子nil(bc3f2)与具有深色微种子的栽培西瓜自交系植物(rz907-02)杂交。所有三个亲本系和来自该杂交的f2群体(181个个体，用104个信息标志物进行基因分型)针对种子颜色和种子尺寸进行表型分析，并对遗传图谱构建进行基因分型。
[0140]
在这些作图群体的发展中，苍白种子颜色性状和微种子尺寸性状均显示出单基因隐性遗传。还清楚的是，苍白种子颜色和微种子尺寸的表型两者都是由产生种子的植物的
基因型决定的。
[0141]
在遗传图谱构建之前，去除了非多态性和非信息标志物以及强偏离个体。在遗传图谱构建期间，构建了两个连锁群。使用物理组装cl_97103_v1(可在http://cucurbitgenomics.org上公开获得)作为参考，对连锁群进行编号和定位。使用来自亲本系和分组结构的标志物信息进行标志物相位校正。使用物理组装cl_97103_v1作为参考执行作图集成。使用r软件包进行qtl分析。
[0142]
在所有4个作图群体中鉴定了3号染色体上苍白种子颜色的数量性状基因座(qtl)。通过精细作图，qtl区域可以缩小到大约110kb的区域，其中包含5个ppo基因和一个未知的预测基因。
[0143]
通过研究苍白种子颜色性状的两种来源的全基因组序列数据并将序列与具有深色种子的材料的全基因组序列数据进行比较，很明显在具有苍白颜色种子的来源的位置cl_97103_v1_chr3:5706705处存在c/ca插入缺失。在位置cl_97103_v1_chr3:5706705处a的插入导致移码，这导致在seq id no：1的ppo基因(该基因在反向链上的基因组中)中引入提前终止密码子。经修饰的ppo基因包含在seq id no：1的核苷酸711和712之间的t的插入。这一碱基对插入导致移码，这导致13个氨基酸被编码在错误的框架中，随后是在经修饰的ppo基因(seq id no：2)的位置751-753处的提前终止密码子。
[0144]
野生型ppo蛋白的大小为587个氨基酸(seq id no：5)，而经修饰的ppo蛋白(seq id no：6)如果完全产生，也只有250个氨基酸长，仅包含其酪氨酸酶结构域的一小部分，完全缺乏其保守的ppo1-dwl和ppo1-kfdv结构域，并且在其c末端包含13个改变的氨基酸。因此突变蛋白没有功能。
[0145]
在位置cl_97103_v1_chr3:5706705处c/ca插入缺失上设计了标志物(命名为cl08381)。seq id no：15代表标志物cl08381的等位基因，其存在于包含本发明的经修饰的ppo基因并产生苍白颜色种子的植物的基因组中。seq id no：14代表该相同标志物的野生型等位基因，其存在于不包含本发明的经修饰的ppo基因的植物基因组中。标志物cl08381的两个标志物等位基因之间不同的核苷酸在下表4中用下划线和粗体表示。经修饰的ppo基因的标志物等位基因(seq id no：15)具有a的单个核苷酸插入，其在表2中用下划线和粗体表示(seq id no：15的位置101)。在所有四个作图群体中，该标志物显示与苍白种子表型的100％相关性。
[0146]
在3个作图群体中确定了2号染色体上微种子尺寸的数量性状基因座(qtl)。在其中两个群体中，qtl间隔仅为1cm。通过研究微种子尺寸性状的两种来源的全基因组序列数据并将序列与具有大或中等尺寸种子的材料的全基因组序列数据进行比较，很明显只有在具有微种子尺寸的材料(距两个qtl群体的峰值标志物约30kb)中存在基因组缺失，对应于西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组的2号染色体上碱基对位置29902114和29916077之间被缺失的13962bp。换言之，从西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组的2号染色体上位置29902115的g开始到西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组的2号染色体上位置29916076的a的所有核苷酸已缺失。序列seq id no：13提供了从2号染色体的位置29897185到29920517的cl_97103_v1基因组序列。赋予微种子尺寸的基因组缺失对应于seq id no：13的碱基对位置4930和18893之间的所有核苷酸的缺失。
[0147]
这种基因组缺失导致两个基因被缺失：seq id no：7的hls1基因和seq id no：10
的bag4基因。
[0148]
设计标志物以检测2号染色体上是否存在基因组缺失(cl_chr2_gap1和cl_chr2_gap2，包括在下表4中)：在包含基因组缺失的材料中，标志物cl_chr2_gap1的引物(seq id no：16和17)扩增446bp的pcr产物，在不包含所述基因组缺失的材料中，这些引物不扩增pcr产物。在不包含所述基因组缺失的材料中，标志物cl_chr2_gap2的引物(seq id no：18和19)扩增945bp的pcr产物，在包含所述基因组缺失的材料中，这些引物不扩增pcr产物。
[0149]
对从产生微种子的植物中分离的dna进行pcr，在使用标志物cl_chr2_gap1的引物(seq id no：16和17)的pcr中得到446bp的pcr产物，而在使用标志物cl_chr2_gap2的引物(seq id no：18和19)的pcr中没有pcr产物。对从产生大种子的植物中分离的dna进行pcr，在使用标志物cl_chr2_gap1的引物(seq id no：16和17)的pcr中没有得到pcr产物，而在使用标志物cl_chr2_gap2的引物(seq id no：18和19)的pcr中得到945bp的pcr产物。对从产生大种子的植物和产生微种子的植物之间的杂交产生的f1植物中分离的dna进行pcr，在使用标志物cl_chr2_gap1的引物(seq id no：16和17)的pcr中得到446bp的pcr产物，而在用标志物cl_chr2_gap2的引物(seq id no：18和19)的pcr中得到945bp的pcr产物。
[0150]
表4：标志物信息。
[0151][0152]
实施例4
[0153]
在一株植物中组合苍白种子颜色和微种子尺寸性状
[0154]
对于具有正常种子尺寸、具有苍白颜色种子的黏籽西瓜植物(rz907-03)与具有深色微种子的栽培西瓜自交系植物(rz907-01)之间的杂交，使用标志物seq id no：14-19选择植物，其中微种子和苍白种子性状均得到固定。除了选择这两个性状外，还选择具有红色果肉和高白利糖度水平的植物。这些选择的植物对于经修饰的ppo基因和2号染色体上对应于西瓜(citrullus lanatus)97103_v1基因组上的碱基对位置29902114和29916077的13962bp缺失两者都是纯合的。图1显示了这种植物的成熟果实的图片。所选植物的成熟果实具有红色果肉和苍白颜色微种子。这些植物的成熟果实的白利糖度水平在9.0白利糖度到14.4白利糖度之间变化。在这种植物上自花授粉产生的种子，成熟果实的平均白利糖度水平为10.0(std 0.87)，以保藏号43364保藏在ncimb。表5和表6显示了对完全发育、成熟和干燥的保藏的种子和具有大或中等尺寸的种子的对照品种的种子和/或具有深色的种子上收集的颜色和种子尺寸数据。
[0155]
表5：对于具有苍白种子颜色和微种子尺寸的保藏ncimb 43364的种子，以及对于不包含本发明的经修饰的ppo基因的棕色(giong品种)和黑色种子(rz907-1)，通过图像分析确定的，以校准的rgb值和校准的cie l*a*b*值(10
°
/d65)表示的完全发育的成熟的干燥种子的平均种子颜色。照片是在黑色背景上拍摄的。
[0156][0157]
表6：对于具有苍白种子颜色和微种子尺寸的保藏ncimb 43364的种子，以及对于不包含本发明的2号染色体上的基因组缺失的中等(giong品种)和大(rz907-04)尺寸种子，通过目测、通过用精密天平称重和用卡尺测量，完全发育的成熟的干燥种子的平均种子尺寸。
[0158][0159]
图2显示了以保藏号43364保藏在ncimb的具有浅色和微种子尺寸的种子(左)，以及具有黑色和大种子尺寸的野生型公众可获得的西瓜品种的种子(右)。条表示尺寸为1cm。
[0160]
实施例5
[0161]
修饰ppo基因以产生苍白种子颜色性状
[0162]
对具有深色种子的目标西瓜植物的种子进行诱变，以便将突变引入基因组中。诱变是使用化学方法实现的，例如ems处理、快中子(fn)辐射或特定的靶向方法，例如crispr。本领域技术人员熟悉用于将突变引入基因组中的化学、辐射和靶向方法。
[0163]
然后使诱变的种子发芽，所得植物自交或杂交以产生m2种子。对负责苍白种子颜色性状的ppo基因修饰进行耕作筛选。基于与seq id no：1和seq id no：3中列出的野生型ppo dna序列的比较来鉴定ppo基因修饰。本领域技术人员也熟悉耕作(mccallum等人,(2000)nature biotechnology,18:455-457)以及用于鉴定核苷酸变化的技术，例如dna测序等。
[0164]
可以基于对ppo基因的修饰来鉴定和选择具有经修饰的ppo基因的西瓜植物。优选地，选择ppo基因敲除突变体(编码提前终止密码子)，但ppo氨基酸改变突变体也可导致苍白种子颜色。可以使用例如sift或provean的预测工具选择最有可能对蛋白质功能有害并因此最有可能导致苍白种子颜色的氨基酸改变突变体。突变体是纯合的或通过本领域技术人员熟悉的自交、杂交或加倍单倍体技术制成纯合的。然后可以用色度计或使用图像分析目测分析所述纯合植物的种子颜色，以确认它们具有苍白种子颜色。
[0165]
实施例6
[0166]
修饰hls1基因和/或bag4基因以产生微种子性状
[0167]
对具有中等或大种子的目标西瓜植物的种子进行诱变，以便将突变引入基因组中。诱变是使用化学方法实现的，例如ems处理、快中子(fn)辐射或特定的靶向方法，例如crispr。本领域技术人员熟悉用于将突变引入基因组中的化学、辐射和靶向方法。
[0168]
然后使诱变的种子发芽，所得植物自交或杂交以产生m2种子。对负责微种子尺寸性状的bag4基因和/或hls1基因修饰进行耕作筛选。基于与seq id no：7和seq id no：8中列出的野生型hls1 dna序列的比较来鉴定hls1基因修饰。基于与seq id no：10和seq id no：11中列出的野生型bag4 dna序列的比较来鉴定bag4基因修饰。本领域技术人员也熟悉耕作(mccallum等人,(2000)nature biotechnology,18:455-457)以及用于鉴定核苷酸变化的技术，例如dna测序等。
[0169]
可以基于对hls1基因的有害突变来鉴定和选择具有非功能性hls1基因的西瓜植物。优选地，选择hls1基因敲除突变体(编码提前终止密码子)，但hls1氨基酸改变突变体也可导致苍白种子颜色。可以使用例如sift或provean的工具选择最可能对蛋白质功能有害并因此导致微种子尺寸的氨基酸改变突变体。
[0170]
可以基于对bag4基因的有害突变来鉴定和选择具有非功能性bag4基因的西瓜植物。优选地，选择bag4基因敲除突变体(编码提前终止密码子)，但bag4氨基酸改变突变体也可导致苍白种子颜色。可以使用例如sift或provean的工具选择最可能对蛋白质功能有害并因此导致微种子尺寸的氨基酸改变突变体。突变体是纯合的或通过本领域技术人员熟悉的自交、杂交或加倍单倍体技术制成纯合的。然后可以通过目测测量或通过使用图像分析来分析所述纯合植物的种子尺寸，以确认微种子尺寸是由对hls1基因和/或bag4基因的一种或多种修饰产生的。
[0171]
序列信息：
[0172]
表1：ppo、hls1和bag4基因和蛋白质序列及其对应的seq id no(“cds”：编码序列)。
[0173][0174]
seq id no:1
[0175]
》ppo_wt_gdna
[0176]
atggcctctctatctccttccatgccactagcactttcctccgccgcaataaccacggccaccaccggcggcgcctcctttggtctgttttatcgtaaaaaaaaagatccatcttccaccattcatagactcaataacttggttgtgtgtagcggctccaatggcagtggtgaagaaagtaataactcattatggccaggcaagtttgttgaccggagagaagcgcttatcgggctcggcggtctgtatggctcagcttcaagtgcttttggagttgatcccttcgctttggcagctccagtcacaacccccgacccttccaagtgtggatcaagcacggacttggcagatggcgtcaaagatttggtttgctgcccaccatccaccaataacgtaaaacccttcctcaaaccacgcgttaggaaagcggcacaatcattagataaagaatatattgaaaagtataaggaagccgtagcgcttatgaaagcgcttcctgatgatgatccacgtagttttaaacagcaagcacttgttcactgtgcttattgtactgggggttacgatcaattgggtcttccagttgaattacaagttcatttctcgtggctgttcttcccattccatcgtttttatctttactttcatgagagaatattggggtctttgattaaggatcctgattttgcattgccgttttggaattatgacgctccgcaagggatggaaataccaaaaatctacacggataaaagttcgtcactctatgatgcatttcgtgacggacgtcatcagccgccgacattggttgatttggattacaatgacgttgagccaacaataagcagagaaaagataatccaatgcaatctaagtgttatgtatcgccaggtcgtgtccggcgcccgtacgcccttgctctttttcggccagccttatcgaagtggcagcaacccaagtccaggtgattttttttttcaaccatataatttcttttttcaaaaaaaggaaaagataaaaaagacaatcatatatagttatggttatgttaggtaatgtttttagtttttgaaaattaatgttaagagtgtttttgggttggattagagcagtttatagatctaactcaattgtcggattgataagttttttcaattcaaataaattctattaaataatgaatcgaattcaactcaatcatgaaatatatgggttcaaattacttaggtcatttatgtaaatttctgttctaaaaataagtaaaatgttaggaaactattataaatggaaaaaaatcaaagtttttacaaatacagaaagatttaattgagtctatcccctaatgataaaagtttatcgcggtttatcacggatagacaatgaaatatttgcaaataatttgactttttttgctatatttgaaaacaaccctaaaatgttaatatgtaaaatttttgttgaattatttttatatattgaattaaaattaacaactcaatttcaatttatattatgaagattttcttttcaaaatgctaaaatattattgtttgaagtttctggagaataaactttccaaaaaattatgaaattaaataaaattaaaataaatatatgtatatataattgtaccataagtaaatcttttataaaagaattataacaagttggggttatttgaagagaacacataaacaactcaaccaataactttttaatttatttgaactcaacctaacccaatcgaaacagtgatgattgggttgtgttgataagttatgctggtcatcaaattgacttgtttttttaatttaatcatttgaaaatgtattctaaacatgcccatttgtaaattagataatgatgtttagagataataattaaggatattagtatggaaagtaaaatgatgtaattttgatgaattgattaattttttgaaaggaatggggacggtggaaaaccttcctcacaattcaattcatttgtggacgggtgacccgaaccaatcgaaccgaattgacatgggaaccttcttctcagcggctagagatcccatcttctacgccca
ccacgcgaacgtggaccgtttttggtccatatggaaatccttaggcgaaaagcgacaagacattaaagacaaagatttcctaaacgcttcctttgtattctacgatgagaatggtgaagctgtccgagtttatgtcaaagactgtctagataccagagccttaggctatgtctacgatgacaccgtaccaattccatggctcaaaacacctccaaccccacgagtaccacgcacacccaacaaaaccaagaagaaatctaccaagaagaccgggaagctaccgtcgagtgttgacaagatcgtcagcttcgaagtcaagaggccgaagaaatcgaggggtacgaaggagaaagacgatgaagaggagattttggtgattgatgggattgagttcgacggaaacaaggctattaagtttgatgtttttatcaatgacgaggatgatagggaaattagagcggataattctgagtttgcagggagctttgtgaatgtgcctcatatgaaaggtagcagcagcatgaacataaaaacatgccttaggttagggataactgaactgcttgagagtttggatgcggataacgacgatagcattattgttacattggtccctaggtttggagatgggtccgccaccgttaaggacattagaattgaatatgatgcataa
[0177]
seq id no: 2
[0178]
》ppo_mut_gdna_具有插入缺失
[0179]
[0180]
[0181][0182]
seq id no: 3
[0183]
》ppo_wt_cds
[0184]
atggcctctctatctccttccatgccactagcactttcctccgccgcaataaccacggccaccaccggcggcgcctcctttggtctgttttatcgtaaaaaaaaagatccatcttccaccattcatagactcaataacttggttgtgtgtagcggctccaatggcagtggtgaagaaagtaataactcattatggccaggcaagtttgttgaccggagagaagcgcttatcgggctcggcggtctgtatggctcagcttcaagtgcttttggagttgatcccttcgctttggcagctccagtcacaacccccgacccttccaagtgtggatcaagcacggacttggcagatggcgtcaaagatttggtttgctgcccaccatccaccaataacgtaaaacccttcctcaaaccacgcgttaggaaagcggcacaatcattagataaagaatatattgaaaagtataaggaagccgtagcgcttatgaaagcgcttcctgatgatgatccacgtagttttaaacagcaagcacttgttcactgtgcttattgtactgggggttacgatcaattgggtcttccagttgaattacaagttcatttctcgtggctgttcttcccattccatcgtttttatctttactttcatgagagaatattggggtctttgattaaggatcctgattttgcattgccgttttggaattatgacgctccgcaagggatggaaataccaaaaatctacacggataaaagttcgtcactctatgatgcatttcgtgacggacgtcatcagccgccgacattggttgatttggattacaatgacgttgagccaacaataagcagagaaaagataatccaatgcaatctaagtgttatgtatcgccaggtcgtgtccggcgcccgtacgcccttgctctttttcggccagccttatcgaagtggcagcaacccaagtccaggaatggggacggtggaaaaccttcctcacaattcaattcatttgtggacgggtgacccgaaccaatcgaaccgaattgacatgggaaccttcttctcagcggctagagatcccatcttctacgcccaccacgcgaacgtggaccgtttttggtccatatggaaatccttaggcgaaaagcgacaagacattaaagacaaagatttcctaaacgcttcctttgtattctacgatgagaatggtgaagctgtccgagtttatgtcaaagactgtctagataccagagccttaggctatgtctacgatgacaccgtaccaattccatggctcaaaacacctccaaccccacgagtaccacgcacacccaacaaaaccaagaagaaatctaccaagaagaccgggaagctaccgtcgagtgttgacaagatcgtcagcttcgaagtcaagaggccgaagaaatcgaggggtacgaaggagaaagacgatgaagag
gagattttggtgattgatgggattgagttcgacggaaacaaggctattaagtttgatgtttttatcaatgacgaggatgatagggaaattagagcggataattctgagtttgcagggagctttgtgaatgtgcctcatatgaaaggtagcagcagcatgaacataaaaacatgccttaggttagggataactgaactgcttgagagtttggatgcggataacgacgatagcattattgttacattggtccctaggtttggagatgggtccgccaccgttaaggacattagaattgaatatgatgcataa
[0185]
seq id no: 4
[0186]
》ppo_mut_cds
[0187][0188]
[0189][0190]
seq id no: 5
[0191]
》ppo_wt_蛋白质
[0192]
maslspsmplalssaaittattggasfglfyrkkkdpsstihrlnnlvvcsgsngsgeesnnslwpgkfvdrrealiglgglygsassafgvdpfalaapvttpdpskcgsstdladgvkdlvccppstnnvkpflkprvrkaaqsldkeyiekykeavalmkalpdddprsfkqqalvhcayctggydqlglpvelqvhfswlffpfhrfylyfherilgslikdpdfalpfwnydapqgmeipkiytdkssslydafrdgrhqpptlvdldyndveptisrekiiqcnlsvmyrqvvsgartpllffgqpyrsgsnpspgmgtvenlphnsihlwtgdpnqsnridmgtffsaardpifyahhanvdrfwsiwkslgekrqdikdkdflnasfvfydengeavrvyvkdcldtralgyvyddtvpipwlktpptprvprtpnktkkkstkktgklpssvdkivsfevkrpkksrgtkekddeeeilvidgiefdgnkaikfdvfindeddreiradnsefagsfvnvphmkgsssmniktclrlgitellesldadnddsiivtlvprfgdgsatvkdirieyda
[0193]
seq id no: 6
[0194]
》ppo_mut_蛋白质
[0195]
maslspsmplalssaaittattggasfglfyrkkkdpsstihrlnnlvvcsgsngsgeesnnslwpgkfvdrrealiglgglygsassafgvdpfalaapvttpdpskcgsstdladgvkdlvccppstnnvkpflkprvrkaaqsldkeyiekykeavalmkalpdddprsfkqqalvhcayctggydqlglpvelqvhfswlffpfhrfylyfherilgslikdpdfalpfwnydcsardgntknlhg
[0196]
seq id no:7
[0197]
》hls1_wt_gdna
[0198]
atggggtttaaaggctttgttattcgaagctacgaagagagtcaattatcagataaagctcaagttatggatcttgaacgaagatgtgaaattggccaatcaaaacgtgtgtttctcttcactgacactttgggtgaccccatttgtaggatacgtaacagtcccatgtataaaatgctggtaatctaatttaattttaattaattgtgtttttttataggttaattaattattaatttgtgaattgaaaattttttattattaaggttgctgagcgggacaaggaagtggttggtgttattcaaggctctataaaaccggttttttttactgctcataaaccgccgcccggtttggtggttaaactgggctacattcttggcctgagagtggcaccgccgtatcgccgccgtggaattggctctagcctcgtccgccgtttggaagattggttcctttctaatgatgttgattactgttgtatggccactgagaaagataatcatgcctctcttaatctcttcatcaataatttgaggtattttccatttttttctttttcttttaagtcaacaattatgaattgggagagagcacggatcgaacaatcatttttaaaatggtaattagtgtcattttatcttatgtgttatactcagattagctattaactctatcttataatgtaggttttgtcagtattttgagaactttcaaatttgtgtctaactagtttttttttccttagttacttaccaaacacgtgataatattattatatgatgaaattttttattttttttatttttttatttattttttattgtggcaagtaggagcatcatacttaccaacaacttaatagatataaaattaaaaatttaatggtcaaatcaaactttttcgagagtaattttaatgttgagttttgcacttttaaatataatttacgtatgattttgaaggattagattcatgtttagtttgaagtggtttagaatctggcaaaagggattttaacaatttcaaactaacgcctctcatatttgtagtttgggacgtcactttgc
tattaattaacaaaatcacatttttggaaattaacatatgattcacatgcaactcgtaaatgaagttaaacttgaaagtttagaggcatattagaaatttctttaaatattctttttcccaacaggtacataaagtttagaacaggaaggatcttggtaaacccagtaagaaatcatccatacaatatgaattcatcagaaatcaacattcaaaagctaaaaatagaagaagcagaagcaatatacaaaaaacacatggcttcaacagagttcttccccaaagacataaaaaacatattgaaaaacaagttgagtttagggacatgggtggcaaatttcaaacaaccgccatggtcgtcgtcgaactctgttggaggaaacgggcagactatggcgagtagctgggccattgtaagtctatggaacagtggggaagttttcaagctaaggctaggaaaagcaccatttccatggcttatctacacaaagagtttaaaaattatggataaaatttttccttgctttaaagtggttttggtgcctaattttttcaagccatttgggttctattttgtttatggattgcaccatgaaggccctttttctgagagattggttggagctttgtgcaaatttgtgcacaatatggcattgaataattcaaaggataattgtaaagctattgttactgagattggaggtgatgaggatgatgggctgaaaatggagattcctcattggaaattgctatcatgttatgaagatttttggtgcataaagtccttgaaaagtaagagatataataatattagtaatgataatgataacgataacgatcacgatcatcatatattggaatggacaaatgcctcacctaatagaactctctttgtagacccaagagaggtataa
[0199]
seq id no:8
[0200]
》hls1_wt_cds
[0201]
atggggtttaaaggctttgttattcgaagctacgaagagagtcaattatcagataaagctcaagttatggatcttgaacgaagatgtgaaattggccaatcaaaacgtgtgtttctcttcactgacactttgggtgaccccatttgtaggatacgtaacagtcccatgtataaaatgctggttgctgagcgggacaaggaagtggttggtgttattcaaggctctataaaaccggttttttttactgctcataaaccgccgcccggtttggtggttaaactgggctacattcttggcctgagagtggcaccgccgtatcgccgccgtggaattggctctagcctcgtccgccgtttggaagattggttcctttctaatgatgttgattactgttgtatggccactgagaaagataatcatgcctctcttaatctcttcatcaataatttgaggtacataaagtttagaacaggaaggatcttggtaaacccagtaagaaatcatccatacaatatgaattcatcagaaatcaacattcaaaagctaaaaatagaagaagcagaagcaatatacaaaaaacacatggcttcaacagagttcttccccaaagacataaaaaacatattgaaaaacaagttgagtttagggacatgggtggcaaatttcaaacaaccgccatggtcgtcgtcgaactctgttggaggaaacgggcagactatggcgagtagctgggccattgtaagtctatggaacagtggggaagttttcaagctaaggctaggaaaagcaccatttccatggcttatctacacaaagagtttaaaaattatggataaaatttttccttgctttaaagtggttttggtgcctaattttttcaagccatttgggttctattttgtttatggattgcaccatgaaggccctttttctgagagattggttggagctttgtgcaaatttgtgcacaatatggcattgaataattcaaaggataattgtaaagctattgttactgagattggaggtgatgaggatgatgggctgaaaatggagattcctcattggaaattgctatcatgttatgaagatttttggtgcataaagtccttgaaaagtaagagatataataatattagtaatgataatgataacgataacgatcacgatcatcatatattggaatggacaaatgcctcacctaatagaactctctttgtagacccaagagaggtataa
[0202]
seq id no:9
[0203]
》hls1_wt_蛋白质
[0204]
mgfkgfvirsyeesqlsdkaqvmdlerrceigqskrvflftdtlgdpicrirnspmykmlvaerdkevvgviqgsikpvfftahkpppglvvklgyilglrvappyrrrgigsslvrrledwflsndvdyccmatekdnhaslnlfinnlryikfrtgrilvnpvrnhpynmnsseiniqklkieeaeaiykkhmasteffpkdiknilknklslgtwvanfkqppwsssnsvggngqtmasswaivslwnsgevfklrlgkapfpwliytkslkimdkifpcfkvvlvpnffkpfgfyfvyglhhegpfserlvgalckfvhnmalnnskdnckaivteiggdeddglkmeiphwkllscyedfwcikslkskrynnisndndndndhdhhilewtnaspnrtlfvdprev
[0205]
seq id no:10
[0206]
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[0207]
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[0237]
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