非人灵长类阿尔茨海默病模型动物及其制备方法与流程

或者3’剪接位点且与该外显子9的剪接相关联的位点缺失。
16.[5]如[3]或[4]所述的方法，其中，非人灵长类为狨猴。
[0017]
此外，在另一方面中，本发明如下所述。
[0018]
[6]非人灵长类阿尔茨海默病模型，其psen1基因的外显子9的受体位点缺失。
[0019]
[7]如[6]所述的灵长类，其中，非人灵长类为狨猴。
[0020]
[8]非人灵长类阿尔茨海默病模型的制备方法，其包括利用基因组编辑技术使psen1基因的外显子9的受体位点缺失的工序。
[0021]
[9]如[8]所述的方法，其特征在于，使卵子中psen1基因的外显子9的受体位点缺失。
[0022]
发明效果
[0023]
根据本发明一方面，能够再现人ad病症。
附图说明
[0024]
图1是示意性表示以本发明可使用的狨猴外显子9的3
’‑
剪接位点为靶的高活性型talen(platinum talen，铂金talen)一例的概略图。图中，方形框所圈部分是talen靶位点及狨猴psen1基因的外显子，数字是指外显子的编号。另外，外显子9的3
’‑
剪接位点(“ag”)位于外显子9的上游侧。
[0025]
图2a是实施例中所实施的、注射talen后狨猴受精卵的surveyor assay分析结果(左侧3列及右侧pc列表示阳性对照，nc列表示阴性对照)，图2b是表示实施例中所实施的、注射talen及其后的psen1 mrna分析概要的示意图，图2c是实施例中所实施的、注射talen后受精卵的rt-pcr结果。
[0026]
图3a是实施例中所获得的、本发明所涉及的狨猴ad模型的新生儿照片，图3b表示以从所述新生儿脐带血中提取的基因组dna为对象实施surveyor assay分析的结果，图3c表示以从所述新生儿及野生型狨猴的毛根提取的rna为对象实施pcr的结果。
[0027]
图4表示从实施例中所获得的基因突变狨猴(8月龄)的耳组织所采集的成纤维细胞中的2种β-淀粉样蛋白质量的测定结果。
[0028]
图5a是实施例4中所获得的、本发明所涉及的狨猴ad模型的新生儿照片，图5b表示以从所述新生儿的脐带血中提取的基因组dna为对象实施surveyor assay分析的结果，图5c表示野生型及基因突变型新生儿基因组中外显子9的3
’‑
剪接位点附近的序列。
[0029]
图6a表示对ps1蛋白(左：n末端片段(ps1 ntf)、右：c末端片段(ps1 ctf))使用抗体，实施成纤维细胞裂解物的蛋白质印迹分析结果，图6b表示从实施例中所获得的基因突变狨猴(8月龄)的耳组织所采集的成纤维细胞中的2种β-淀粉样蛋白质量的测定结果。成纤维细胞均从实施例4中所获得的基因突变狨猴(8月龄)的耳组织采集。
具体实施方式
[0030]
本发明涉及非人灵长类ad模型。关于非人灵长类，只要是会罹患阿尔茨海默病的灵长类，则无特别限定。例如，作为灵长类，可以列举卷鼻类(狐猴类、懒猴类、丛猴等)及直鼻类(眼镜猴类、蜘蛛猴类、卷尾猴类、狨猴类、猕猴类、疣猴类、类人猿等)，但并不限定于这些。在优选的技术方案中，非人灵长类为猕猴类(恒河猴、食蟹猴等)、狨猴类(普通狨、黑羽
狨等)。本技术方案的狨猴ad模型适用于ad的研究。作为其原因，可举出以下的特征：狨猴的遗传背景和脑结构与人类似，能进行与前额叶相关联的、类似人类的认知行为，能够开展视觉交流及听觉交流，并且，小的体形(例如，350-500g)，较短的妊娠期间(145天)，能够有效地繁殖(每1只雌性可以繁殖40至80只的新生儿)，较长的寿命(饲养条件下10～13年)。并且，随着从7岁龄左右开始的衰老，发现有β-淀粉样蛋白蓄积，β-淀粉样蛋白的序列和人相同，这也是其适用于ad研究的原因。
[0031]
本发明所涉及的狨猴ad模型，其特征在于，psen1基因的外显子9的剪接位点被破坏。破坏是使用本身已知的基因组编辑技术来进行即可，例如可以使用crispr-cas9系统或talen(transcription activator-like effector nuclease)来实施。在一技术方案中，优选使用高活性型talen(platinum talen)。另外，已有报告指出：包含外显子9的缺失突变或psen1基因的外显子9的剪接位点的点突变会因选择性剪接引发mrna外显子9的跳跃；但实际上本发明人等是首次根据所述位点的破坏成功地制作出了非人灵长类ad模型。
[0032]
图1示意性表示以狨猴psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点为靶的高活性型talen(platinum talen)。图中，左侧所示talen_as_l以及右侧所示talen_as_r分别例如可以使用铂金门talen试剂盒，根据本身已知的方法进行构建。talen_as_l以及talen_as_r为talen靶位点，方形所圈住的序列为狨猴psen1基因的外显子，在外显子9的上游邻接的粗体字“ag”为外显子9的3
’‑
剪接位点。此外，5
’‑
剪接位点是在外显子9的下游邻接的“gt”(未图示)。
[0033]
在优选的实施方式中，如图1所示，术语“psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点”是指存在于内含子8的3’末端的2核苷酸以便进行外显子8及外显子9的剪接。“psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点的缺失(deficiency)”意指该3
’‑
剪接位点的功能不完整性(deficiency)。上述缺失是由上述2核苷酸之中的一个或两个(仅核苷酸a、仅核苷酸g、或者两者的核苷酸ag)的缺失(deletion)所致(参照图2及3)。在该实施方式中，“至少包含psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点(与该外显子9的剪接相关联)的位点缺失”必须是由上述缺失造成的。
[0034]
上述缺失是内含子8的3’末端(包含上述核苷酸ag)及外显子9的5’末端的部分缺失；是内含子8的3’末端(包含上述核苷酸ag或者核苷酸a)的部分缺失；以及核苷酸g或者核苷酸ag、及外显子9的5’末端的部分缺失。关于造成上述缺失的缺失全长，只要该缺失包含上述2核苷酸之中的一个或两个并且不会影响除外显子9以外的外显子的剪接，则任意。
[0035]
在不同于图1所示的优选实施方式的其他实施方式中，上述缺失也可以由psen1基因的外显子9的5
’‑
剪接位点缺失所致。关于该其他实施方式中的上述缺失的意义，通过将前2个段落的表述中的以下内容进行替换，就能理解。
[0036]
1.将“3
’‑
剪接位点”替换为“5
’‑
剪接位点”。
[0037]
2.将“外显子8及外显子9”替换为“外显子9及外显子10”。
[0038]
3.将“内含子8的3’末端”替换为“内含子9的5’末端”。
[0039]
4.将“外显子9的5’末端”替换为“外显子9的3’末端”。
[0040]
5.将“核苷酸a”替换为“核苷酸g”，将“核苷酸g”替换为“核苷酸t”，将“核苷酸ag”替换为“核苷酸gt”。
[0041]
在不同于上述两个实施方式的实施方式中，存在于内含子上的分支位点的缺失会
造成“至少包含psen1基因的外显子9的5
’‑
剪接位点或3
’‑
剪接位点(与该外显子9的剪接相关联)的位点缺失”。内含子可以是psen1基因的内含子8、内含子9、或者内含子8及9两者。已知分支位点多位于内含子内的3’末端附近，该位点的下游接有多聚嘧啶碱基区(py的重复)。在本发明的一技术方案中，分支位点可以是位于3
’‑
剪接位点的20～40核苷酸(被称为21～34核苷酸)上游的包含核苷酸a的位点。分支位点的缺失是指至少上述核苷酸a缺失。
[0042]
另外，本发明所涉及的狨猴ad模型的基因组中可以同时存在上述不同的3个缺失，或者可以同时存在3个缺失之中的任意2个缺失。
[0043]
本发明所涉及的狨猴ad模型制备方法的一例如下所述。在狨猴受精卵的细胞核中导入以狨猴psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点为靶的talen mrna。可以在亚克隆后进行surveyor assay分析以及测序分析，也可以仅取出包含3
’‑
剪接位点的靶位点发生缺失的胚胎。例如，可以按照3个中的2个这一高的概率发生缺失。导入talen之后可以进行rt-pcr及cdna测序，确认psen1的mrna中外显子9的跳跃。根据该方法，从4细胞期的受精卵或单卵裂球提取的rna中不存在野生型序列，可以使等位基因中发生3
’‑
剪接位点的缺失。
[0044]
优选在卵子中导入talen mrna并诱导受精。受精后使受精卵发育到6细胞期以上，然后能够移植到代孕母体中。通过所述talen导入，在妊娠或其后的发育中不会引发明显的副作用。这样就可以获得具有包含杂合状态3
’‑
剪接位点的、例如6bp缺失的狨猴。关于所获得的狨猴ad模型的mrna(例如，从狨猴的毛根样本提取的mrna)，可以实施rt-pcr及其后所接的cdna的测序，确认外显子9的跳跃。
[0045]
如后述实施例所述，和野生型狨猴相比，本发明的狨猴ad模型的β-淀粉样蛋白aβ
42
以及aβ
40
的存在量的比率aβ
42
/aβ
40
变高。例如，和野生型相比，本发明的狨猴ad模型的aβ
42
/aβ
40
值为1.4倍以上、1.6倍以上、1.8倍以上、或2倍以上。
[0046]
实施例
[0047]
以下示出实施例，但本发明并不仅限于这些实施例。
[0048]
以下动物实验均依照基于“关于动物的爱护及管理的法律”“关于实验动物的饲养、保管及减轻苦痛的基准”“关于在研究机构等开展动物实验等的基本指南(文部科学省告示)”制定的公益财团法人实验动物中央研究所的“动物实验等规程”开展的。
[0049]
[材料及方法]
[0050]
talen质粒的制作
[0051]
talen质粒是使用铂金门talen试剂盒(addgene)，按照如scientific reports 2013,nov 29；3:3379.doi:10.1038/srep03379中记载的方法进行制作。简而言之，如下所述。通过采用铂金门talen(platinum gate talen)试剂盒(addgene；cat#1000000043)的两步金门组装法(two-step golden gate assembly method)，构建包含同二聚体型foki核酸酶结构域的铂金talen。将所组装的重复阵列连续导入最终的目的载体(destination vector)即ptcmv-153/47-vr中。talen mrna是使用“mmessage mmachine t7超转录试剂盒”(赛默飞世尔科技公司，am1345)进行制作。转录mrna(transcribed mrna)是使用“megaclear转录清洁试剂盒”(赛默飞世尔科技公司，am1908)进行纯化。所制作的质粒的全长序列如序列表中序列号1(左_talen)以及序列号2(右_talen)所示。
[0052]
[talen载体序列]
[0053]
[序列号1]
[0054]
agaaggggctcccgcacgcgcctgcattgattaagcggaccaacagaaggatccccgagaggacatcacatcgagtggcaggttcccaactcgtgaagagtgaacttgaggagaaaaagtcggagctgcggcacaaattgaaatacgtaccgcatgaatacatcgaacttatcgaaattgctaggaactcgactcaagacagaatccttgagatgaaggtaatggagttctttatgaaggtttatggataccgagggaagcatctcggtggatcacgaaaacccgacggagcaatctatacggtggggagcccgattgattacggagtgatcgtcgacacgaaagcctacagcggtgggtacaatcttcccatcgggcaggcagatgagatgcaacgttatgtcgaagaaaatcagaccaggaacaaacacatcaatccaaatgagtggtggaaagtgtatccttcatcagtgaccgagtttaagtttttgtttgtctctgggcatttcaaaggcaactataaggcccagctcacacggttgaatcacattacgaactgcaatggtgcggttttgtccgtagaggaactgctcattggtggagaaatgatcaaagcgggaactctgacactggaagaagtcagacgcaagtttaacaatggcgagatcaatttccgctcataaaaaatcagcctcgactgtgccttctagttgccagccatctgttgtttgcccctcccccgtgccttccttgaccctggaaggtgccactcccactgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcatcacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctctgcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagctcccgggagcttgtatatccattttcggatctgatcagcacgtgatgaaaaagcctgaactcaccgcgacgtctgtcgagaagtttctgatcgaaaagttcgacagcgtttccgacctgatgcagctctcggagggcgaagaatctcgtgctttcagcttcgatgtaggagggcgtggatatgtcctgcgggtaaatagctgcgccgatggtttctacaaagatcgttatgtttatcggcactttgcatcggccgcgctcccgattccggaagtgcttgacattggggaattcagcgagagcctgacctattgcatctcccgccgtgcacagggtgtcacgttgcaagacctgcctgaaaccgaactgcccgctgttctgcagccggtcgcggaggccatggatgcgatcgctgcggccgatcttagccagacgagcgggttcggcccattcggaccgcaaggaatcggtcaatacactacatggcgtgatttcatatgcgcgattgctgatccccatgtgtatcactggcaaactgtgatggacgacaccgtcagtgcgtccgtcgcgcaggctctcgatgagctgatgctttgggccgaggactgccccgaagtccggcacctcgtgcacgcggatttcggctccaacaatgtcctgacggacaatggccgcataacagcggtcattgactggagcgaggcgatgttcggggattcccaatacgaggtcgccaacatcttcttctggaggccgtggttggcttgtatggagcagcagacgcgctacttcgagcggaggcatccggagcttgcaggatcgccgcggctccgggcgtatatgctccgcattggtcttgaccaactctatcagagcttggttgacggcaatttcgatgatgcagcttgggcgcagggtcgatgcgacgcaatcgtccgatccggagccgggactgtcgggcgtacacaaatcgcccgcagaagcgcggccgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcgccgatagtggaaaccgacgccccagcactcgtccgagggcaaaggaatagcacgtgctacgagatttcgattccaccgccgccttctatgaaaggttgggcttcggaatcgttttccgggacgccggctggatgatcctccagcgcggggatctcatgctggagttcttcgcccaccccaacttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctgtataccgtcgacctctagctagagcttggcgtaatcatggtcattaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagcgctgcgatgataccgcgagaaccacgctcaccggctccggatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccatcgctac
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[0055]
[序列号2]
[0056]
agaaggggctcccgcacgcgcctgcattgattaagcggaccaacagaaggatccccgagaggacatcacatcgagtggcaggttcccaactcgtgaagagtgaacttgaggagaaaaagtcggagctgcggcacaaattgaaatacgtaccgcatgaatacatcgaacttatcgaaattgctaggaactcgactcaagacagaatccttgagatgaaggtaatggagttctttatgaaggtttatggataccgagggaagcatctcggtggatcacgaaaacccgacggagcaatctatacggtggggagcccgattgattacggagtgatcgtcgacacgaaagcctacagcggtgggtacaatcttcccatcgggcaggcagatgagatgcaacgttatgtcgaagaaaatcagaccaggaacaaacacatcaatccaaatgagtggtggaaagtgtatccttcatcagtgaccgagtttaagtttttgtttgtctctgggcatttcaaaggcaactataaggcccagctcacacggttgaatcacattacgaactgcaatggtgcggttttgtccgtagaggaactgctcattggtg
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ttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggtcagtgttacaaccaattaaccaattctgaacattatcgcgagcccatttatacctgaatatggctcataacaccccttgctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttacgcgcgcgtcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttagcccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaaggcgagagtagggaactgccaggcatcaaactaagcagaaggcccctgacggatggcctttttgcgtttctacaaactctttctgtgttgtaaaacgacggccagtcttaagctcgggccccctgggcggttctgataacgagtaatcgttaatccgcaaataacgtaaaaacccgcttcggcgggtttttttatggggggagtttagggaaagagcatttgtcagaatatttaagggcgcctgtcactttgcttgatatatgagaattatttaaccttataaatgagaaaaaagcaacgcactttaaataagatacgttgctttttcgattgatgaacacctataattaaactattcatctattatttatgattttttgtatatacaatatttctagtttgttaaagagaattaagaaaataaatctcgaaaataataaagggaaaatcagtttttgatatcaaaattatacatgtcaacgataatacaaaatataatacaaactataagatgttatcagtatttattatcatttagaataaattttgtgtcgcccttaattgtgagcggataacaattacgagcttcatgcacagtggcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggaagcttcttgttctttttgcagaagctcagaataaacgctcaactttggcctcgaggccaccatggactataaggaccacgacggagactacaaggatcatgatattgattacaaagacgatgacgataagatggccccaaagaagaagcggaaggtcggtatccacggagtcccagcagccgtagatttgagaactttgggatattcacagcagcagcaggaaaagatcaagcccaaagtgaggtcgacagtcgcgcagcatcacgaagcgctggtgggtcatgggtttacacatgcccacatcgtagccttgtcgcagcaccctgcagcccttggcacggtcgccgtcaagtaccaggacatgattgcggcgttgccggaagccacacatgaggcgatcgtcggtgtggggaaacagtggagcggagcccgagcgcttgaggccctgttgacggtcgcgggagagctgagagggcctccccttcagctggacacgggccagttgctgaagatcgcgaagcggggaggagtcacggcggtcgaggcggtgcacgcgtggcacaatgcgctcacgggagcacccctcaacctgaccccagaccaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggaccacggcctgacccccgaacaggttgtcgctattgctagtaacggcggaggcaaacaggc
gctggaaacagttcagcgcctcttgccggtcttgtgtcaggcccacggcctgacccccgaccaggttgtcgctattgctagtaacggcggaggcaaacaggcgctggaaacagttcagcgcctcttgccggtcttgtgtcaggcccacggcctgaccccggcccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggaccacggcctgaccccagaccaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggaccacggcctgaccccggaacaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggcccacggcctgaccccggaccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggcccacggcctgaccccagcccaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggaccacggcctgaccccagaccaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggaccacggcctgaccccggaacaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggcccacggcctgaccccggaccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggcccacggcctgaccccagcccaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggaccacggcctgaccccggaccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggaccacggcctgaccccagaacaggttgtggccatcgccagcaacataggtggcaagcaggccctcgaaaccgtccagagactgttaccggttctctgccaggcccacggcctgaccccggaccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggcccacggcctgaccccggcccaggtggttgcaatcgcgtcacacgatgggggaaagcaggccctagaaaccgttcagcgactcctgcccgtcctgtgccaggaccacggcctgacgcctgagcaggtagtggctattgcatccaacatagggggcagacccgcactggagtcaatcgtggcccagctttcgaggccggaccccgcgctggccgcactcactaatgatcatcttgtagcgctggcctgcctcggcggacgacccgccttggatgcggtga。
[0057]
成熟培养及体外受精
[0058]
将注射了talen的卵子在添加有灭活的fbs(最终浓度5％)、hfsh(富士制药，最终浓度0.15iu/ml)、hcg(aska制药，最终浓度10iu/ml)的pom培养基(功能性肽研究所/ifp1010p)中进行成熟培养24小时以上，挑选成熟至mi(metaphase i，第一中期)期以上的卵子。为了受精所用的精子是从野生型雄性的狨猴进行采集，使用tyh培养基(lsi medience/dr01031)进行体外受精(in vitro fertilization：ivf)。第二天(ivf开始后大约16小时后)解除ivf，以原核细胞的有无为基准，判定受精的成功与否，挑选所获得的受精卵。
[0059]
胚胎移植和妊娠管理
[0060]
受精卵是使用sequencial cleav.(origio/83040010a)进行早期的体外培养，在从培养开始经过2-3天的时点，挑选已发育到4细胞期以上的胚胎。后期的体外培养是使用在sequencial blast(origio/83060010a)中添加有灭活的fbs(最终浓度10％)、l-谷氨酰胺(最终浓度2mm)的培养基进行，从talen的注射一周后采用无创导管插入术移植到代孕母体的子宫中。胚胎移植后，通过对代孕母体的血液中p4值的测定，或利用超声波诊断装置对子宫的观察，以判定是否妊娠，对于已确定妊娠的个体，开展每周1次的定期体检，观察胎儿的心律状况、有无形态异常等。分娩是基本采用自然分娩，如果鉴于代孕母体及胎儿的状况，判断为自然分娩困难时，采用剖腹产手术获得幼崽。
[0061]
基因组dna分析
[0062]
使用qiaamp dna micro试剂盒(凯杰/56304)，从幼崽的体毛或进行剖腹产时所得的脐带血中回收基因组dna。用于分析psen1基因的pcr反应是使用kod plus neo(东洋纺/401)和2个引物psen1_ex9_up1(acccgcgactccctattatt：序列号3)、psen1_ex9_dn1(tgccttgactgtattgttgg：序列好4)来进行，反应条件为以94℃加热2分钟后按照98℃10秒、60℃10秒、68℃30秒实施35次循环，反应结束后通过使部分于琼脂糖凝胶上进行电泳，来确认扩增的有无。将部分的扩增产物供于能够可视地检测基因改造的surveyor assay分析，另一方面，使用zero blunt pcr克隆试剂盒(赛默飞世尔科技公司/k275040)克隆到序列载体上，并将质粒导入大肠杆菌(dh5α株)进行转化。从由此所获得的亚克隆回收质粒进行序列分析。
[0063]
cdna分析
[0064]
使用nucleospin rna plus xs(takara/u0990b)，从幼崽的体毛或进行剖腹产时所得的脐带血中回收总rna之后，使用revertra ace-α-(东洋纺/fsk-101)进行合成cdna。用于psen1基因的外显子9缺失的确认的pcr反应是使用kod plus neo和设计于附近外显子上的2个引物对：pn1_on_ex7_up1(tacctccctgaatggactgc：序列号5)及pn1_on_ex11_dn2(tggttgtgttccagtctcca：序列号6)；以及pn1_on_ex8_up1(ggtccacttcgtatgctggt：序列号7)及pn1_on_ex11_dn1(ggctgttgctgaggctttac：序列号8)中的任一个来进行，反应条件为在94℃2分钟的加热后，按照98℃10秒、60℃10秒、68℃30秒实施35次循环。对结束反应的样本是用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳，以捕捉扩增产物的条带转移，进行推测外显子9的缺失。部分的扩增产物是使用zero blunt pcr克隆试剂盒克隆到序列载体上，并将质粒导入大肠杆菌(dh5α株)进行转化。从由此所获得的亚克隆回收质粒进行序列分析。
[0065]
原代培养
[0066]
将少量采集了的幼崽的耳朵组织进行切碎。将组织片粘贴于细胞培养用培养皿上，用已添加有10％灭活fbs的d-mem(赛默飞世尔科技公司/10566016)在37℃、5％co2环境下进行培养。
[0067]
实施例1
[0068]
将以狨猴psen1基因的外显子9的3
’‑
剪接位点为靶的talen mrna导入狨猴受精卵的细胞核之后，在亚克隆后实施surveyor assay分析以及测序分析。如图2a所示，发现3个受精卵中的2个如预期般在包含3
’‑
剪接位点序列的靶位点上发现有缺失。继而，将talen注射到狨猴受精卵后进行rt-pcr及cdna测序，确认了psen1 mrna中外显子9的跳跃。如图2b所示，注射talen后，从达到4细胞期的受精卵或单卵裂球提取rna。如图2c所示，外显子9的完全跳跃在2个4细胞期受精卵及2个单卵裂球中被发现。这些3
’‑
剪接位点缺失的受精卵及单卵裂球均无野生型序列。由此可以判断，3
’‑
剪接位点的缺失可以考虑是以二等位基因(biallelic)形式而产生的。ps1蛋白的基质为包含淀粉样前体蛋白(app)和缺口(notch)的ⅰ型跨膜蛋白即γ-分泌酶复合物的催化亚单位。由外显子9编码的区域存在于自溶(endoproteolysis，内切蛋白酶解)位点，γ-分泌酶的成熟有必要在该位点断裂，因此，外显子9的跳跃会导致γ-分泌酶功能丧失。狨猴psen1外显子9的缺失纯合子会因notch信号传导的破坏而引起胎死。
[0069]
实施例2
[0070]
基于由受精卵所取得的结果，如上所述将talen mrna导入卵子中，并试着诱导受精。受精后使受精卵发育到桑葚期，然后移植到代孕母体中。导入talen在妊娠或其后的发育过程中没有引发明显的副作用。按照这种方式获得了具有包含杂合状态3
’‑
剪接位点的6bp缺失的f0狨猴(psen1-δe9)(新生儿照片如图3a所示)。以从脐带血中提取的基因组dna为对象实施surveyor assay分析。结果如图3b所示。图3b中，作为模板，左侧2列表示使用新生儿基因组dna(图3a中从新生儿脐带血中提取的基因组dna)实施surveyor assay分析(泳道1：图3a中新生儿的基因组dna及野生型对照血液(cb)样本的混合物，泳道2：仅新生儿基因组dna)的结果。右侧2列表示实验中的对照(+为阳性对照，-为阴性对照)。图3c表示以从所获得的基因突变狨猴及野生型狨猴的毛根提取的rna为对象实施pcr的结果。右侧2列表示针对同一rna样本，不使用rt进行反应的阴性pcr数据。如图3c所示，外显子9被跳跃的pcr产物条带表现为315bp，野生型条带表现为402bp。另外，所分析的受精卵均显示仅为单条带，因此可以判断未发生杂合突变。
[0071]
实施例3
[0072]
用elisa(和光纯药，294-62501、290-62601)对野生型及psen1-δe9(i774gmf)狨猴原代成纤维细胞培养液中的aβ进行了测定。结果如图4所示。在psen1-δe9狨猴成纤维细胞中，发现aβ
40
减少，aβ
42
增加，aβ
42
/aβ
40
比值增加，表示psen1-δe9突变具有致病性(构成病因)。
[0073]
关于发现有psen1基因改造的2只个体，基因组dna分析及cdna分析结果中的正常型psen1和外显子9缺失型psen1的表达比例约各占一半，因此这强烈地显示了人的患者所见到的异型psen1-δe9再现。此外，从成纤维细胞培养液中aβ定量的结果，再现了aβ生成序列谱的异常，从而可以判断所制作的psen1-δe9狨猴再现了ad病症。此外，和常规的利用基因组编辑使外显子两端断裂、缺失的方法或敲入方法相比，本次通过在3
’‑
剪接位点导入突变从而进行外显子跳跃的这一方法可以通过在基因组dna上的1处诱导dna双链断裂来实现，因此可以说是效率高、可用性高。可以判断如此针对与剪接相关联的序列，利用基因组编辑导入突变，从而再现疾病(阿尔茨海默病)病症的疾病模型制作方法是有用的方法。再者，可以判断像本发明这样的，即纯合子在以有可能导致胚胎致死的基因突变为靶的情况下，利用卵子进行基因组编辑，然后使其受精的方法是能够避免胚胎致死的有效手段。
[0074]
实施例4
[0075]
按照和实施例2同样的步骤进而得到2只个体的psen1-δe9新生儿(i943gmm及i949gmm)(图5a)。针对加上i774gmf共计3只个体，以从脐带血中提取的基因组dna为对象实施surveyor assay分析。结果如图5b所示。图5b的下部所示的符号分别表示如下内容，cb：从新生儿的脐带血中提取的基因组，hr：从新生儿的毛根提取的基因组，m：标志物，+n：添加正常基因组，+及-：试剂对照。另外，如图5c所示，i774gmf及i943gmm在psen1基因中具有包含杂合状态的3
’‑
剪接位点的6bp缺失，i949gmm在psen1基因中具有包含杂合状态的3
’‑
剪接位点的9bp缺失。
[0076]
利用蛋白质印迹法对于从野生型(i774gmf)及psen1-δe9(i943gmm及i949gmm)狨猴的成纤维细胞所获得的膜组分中的ps1蛋白进行分析。结果如图6a所示。左侧基因组套(panel)是使用了对ps1蛋白n末端片段(ntf)的抗体的结果。右侧基因组套是使用了对ps1蛋白c末端片段(ctf)的抗体的结果。箭头是指由ps1豌豆蛋白分解而生成的ntf及ctf，箭形
符号是指全长ps1蛋白。使用了钠-钾atp酶作为膜组分负荷量的对照。
[0077]
此外，用夹心elisa(和光纯药，294-62501、290-62601)对上述原代成纤维细胞培养液中的aβ进行定量。结果如图6c所示。图6c表示平均值
±
标准误差(wt：n＝15，δe9：n＝9)。图6c中**p≦0.01、****p≦0.0001是基于student's双尾t检验而显示有显著性差异。和实施例3同样，发现aβ
40
减少，aβ
42
增加，aβ
42
/aβ
40
比值增加。另外，aβ
43
水平低于检出限，因此未图示。
[0078]
产业上的利用可能性
[0079]
本发明的非人灵长类ad模型对于阿尔茨海默病的诊断及治疗方法的开发极为有用。
[0080]
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序列表
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