心肌细胞冻存方法与流程

1.本发明涉及细胞冻存技术领域，具体涉及一种心肌细胞的冻存方法。


背景技术：

2.心血管疾病每年导致大约1700万人死亡，是全球疾病死亡的主要原因，由于复杂的致病机理，心血管疾病目前难以预防。2006年日本科学家山中伸弥团队利用病毒将4个转录因子转入分化的成纤维细胞中获得了诱导多能干细胞，诱导多能干细胞技术的发展避免了胚胎干细胞遇到的伦理学问题，为相关疾病的研究和治疗提供了可能。
3.诱导多能干细胞具有分化成各种功能性细胞的潜能，同样地，诱导多能干细胞通过调节相应的信号通路能够产生具有收缩功能的心肌细胞，具有稳定电生理特性的心肌细胞不仅可以用于研究心脏疾病的发病机理、筛选治疗心脏疾病的药物，甚至可以开展心肌细胞治疗心脏疾病的临床研究，进一步拓展心肌细胞在心肌梗死、心脏衰竭等疾病治疗中的贡献。
4.心肌细胞的储存和运输是心脏疾病发病机理研究，心脏疾病治疗的前提，心肌细胞的应用离不开心肌细胞的冻存复苏。但是心肌细胞特有的电生理活性使其不同于其他干细胞或分化的细胞，目前常见的细胞冻存液有间充质干细胞冻存液、造血干细胞冻存液、免疫细胞冻存液、外周血单核细胞冻存液。目前尚未发现结合心肌细胞生理活性开发的心肌细胞冻存液。
5.文献effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles披露了一种包括90％的胎牛血清以及10％的dmso的冻存液冻存诱导多能干细胞分化的心肌细胞，但是冻存复苏后的心肌细胞的心肌收缩力降低、电生理活性相较于未经冻存的心肌细胞有不同程度的改变，说明心肌细胞经该冻存液冻存后，生理活性发生改变，严重影响了心肌细胞储存过程中的稳定性。
6.目前尚未发现结合心肌细胞冻存复苏后的细胞活率及电生理特性开发的心肌细胞冻存或复苏方法。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明实施例提供了一种心肌细胞冻存方法，所述心肌细胞冻存方法中，心肌细胞以1.0～5.0
×
106个细胞/ml的密度冻存于心肌细胞冻存液中，其中，所述心肌细胞冻存液包括dmso、人血白蛋白、羟乙基淀粉和氯化钠溶液。
8.优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞以单细胞的形式冻存于所述心肌细胞冻存液中。
9.优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括0.5％～10％的dmso、10％～25％的人血白蛋白、0.01～0.05g/ml的羟乙基淀粉以及0.585％～0.805％的氯化钠溶液。
10.进一步优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括10％的dmso、20％的人血白蛋白、0.033g/ml的羟乙基淀粉以及浓度为0.63％的氯化钠溶液。
11.优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，，所述心肌细胞冻存液包括dmso、人血白蛋白、羟乙基淀粉、rock抑制剂y27632、抗坏血酸、葡萄糖和氯化钠溶液。
12.进一步地，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括0.5％～10％的dmso、10％～25％的人血白蛋白、0.01～0.05g/ml的羟乙基淀粉、1～10μm的rock抑制剂y27632、0.5～1.0g/l的抗坏血酸、2.5～7.5g/l的葡萄糖以及0.675％～0.805％的氯化钠溶液。
13.更进一步优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞冻存液包括10％的dmso、20％的人血白蛋白、0.033g/ml的羟乙基淀粉、8μm的rock抑制剂y27632，0.8g/l的抗坏血酸、5g/l的葡萄糖以及0.9％的氯化钠溶液。
14.其中优选的是，所述心肌细胞冻存方法中，所述心肌细胞以3.5
×
106个细胞/ml的密度冻存于心肌细胞冻存液中。
15.本发明实施例提供的心肌细胞冻存方法能够使心肌细胞在冻存12个月后仍维持较高的细胞活率及稳定的心肌细胞电生理活性，促进心肌细胞在药物药理毒理筛查及临床治疗方面的应用。
附图说明
16.图1为未经冻存的心肌细胞的动作电位，其中该动作电位时长为416.10
±
32.61。
具体实施方式
17.下面结合附图及具体实施例对本发明技术方案进行进一步描述，实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法，实验所用的仪器和试剂皆可通过商业途径获得。
18.本发明实施例采用的试剂来源如下：
[0019][0020][0021]
实施例1心肌细胞冻存液的配制
[0022]
1：配制包含90％胎牛血清以及10％dmso的心肌细胞冻存液；
[0023]
2：将0.8g羟乙基淀粉溶于70ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入0.3ml的dmso和30ml的人血白蛋白；
[0024]
3：将1g羟乙基淀粉溶于75ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别
加入0.5ml的dmso和25ml的人血白蛋白；
[0025]
4：将5g羟乙基淀粉溶于80ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10ml的dmso和10ml的人血白蛋白；
[0026]
5：将1g羟乙基淀粉、0.1μmol rock抑制剂y27632、0.25g葡萄糖溶于70ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入5ml的dmso和25ml的人血白蛋白；
[0027]
6：将5g羟乙基淀粉、1μmol rock抑制剂y27632、0.75g葡萄糖溶于90ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入0.5ml的dmso和10ml的人血白蛋白；
[0028]
7：将3.3g羟乙基淀粉溶于70ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10ml的dmso和20ml的人血白蛋白；
[0029]
8：将3.3g羟乙基淀粉、8μmol rock抑制剂y27632、0.5g葡萄糖溶于70ml浓度为0.9％的生理盐水中，待其完全溶解后再分别加入10ml的dmso和20ml的人血白蛋白。实施例2心肌细胞的冻存复苏方法
[0030]
本发明实施例采用诱导多能干细胞分化的心肌细胞进行冻存液的筛选，所述诱导多能干细胞在含有chir99021的rpmi1640培养基中培养48h后，将培养基更换为含有iwr-1的心肌细胞分化培养基，培养48h后用心肌细胞分化培养基继续培养，并每隔48h换液。培养至第8天可观察到细胞跳动。
[0031]
ctnt是tnnt2基因的表达产物，是一种心肌特异型的肌钙蛋白，仅在心肌细胞中表达，因此可用作鉴定心肌细胞的特异性标志物。采用流式细胞术分析细胞ctnt的表达量，确定心肌细胞的纯度。随着分化时间的延长，心肌细胞的成熟度也逐渐增加。
[0032]
将分化至8天、15天、21天的心肌细胞分别消化为单细胞，并将其在实施例1中提供的心肌细胞冻存液中在-80℃冰箱冻存16～24h，然后转移至液氮罐中长期储存，其中心肌细胞的冻存密度为1.0～5.0
×
106个细胞/ml。
[0033]
将冻存的心肌细胞从液氮储罐中取出，将其置于37℃的恒温水浴锅中，轻轻晃动1～2min，待冻存的心肌细胞由固体转为液体后，分别以2滴/秒的速度逐滴向其中添加4℃、浓度为20％、15％、10％以及5％的人血白蛋白氯化钠溶液。其中，人血白蛋白氯化钠溶液的添加量为10ml/106个细胞。
[0034]
复苏液人血白蛋白溶液的配制方法如下：
[0035]
20％的人血白蛋白溶液为baxter购买的原溶液；
[0036]
15％的人血白蛋白溶液为75％体积的人血白蛋白溶液和25％体积的生理盐水混合均匀；
[0037]
10％的人血白蛋白溶液为50％体积的人血白蛋白溶液和50％体积的生理盐水混合均匀；
[0038]
5％的人血白蛋白溶液为25％体积的人血白蛋白溶液和75％体积的生理盐水混合均匀。
[0039]
取实施例1第5组心肌细胞冻存液冻存的心肌细胞进行复苏，结果显示，20％的人血白蛋白溶液为复苏液时，冻存心肌细胞复苏后的活率为76.5％，随着人血白蛋白溶液浓度的降低，心肌细胞复苏后的活率逐渐提高，当复苏液为5％的人血白蛋白溶液时，心肌细胞活率为83.25％。实施例1其他组冻存液冻存的心肌细胞同样随着复苏液中人血白蛋白的浓度减少而有不同程度的增加。
[0040]
另外，复苏液添加的速度同样会影响心肌细胞的活率，当复苏液滴加的速度为0.5滴/秒时，心肌细胞活率提高12％。
[0041]
实施例3冻存对心肌细胞活率的影响
[0042]
对冻存复苏的心肌细胞利用pi染色法计算心肌细胞活率，表1为不同心肌细胞冻存液冻存6个月对分化至第8天的心肌细胞活率的影响：
[0043]
表1：不同心肌细胞冻存液冻存分化第21天的心肌细胞6个月时的细胞活率
[0044]
冻存液12345678细胞活率47.25％65.5％72.5％72.75％83.25％81.75％91.5％93.25％
[0045]
由此可见，相对于本发明实施例1中第1组的心肌细胞冻存液，本发明实施例提供的第2至8组对心肌细胞的活率有显著的提高。心肌细胞在第7组及第8组的心肌细胞冻存液中冻存6个月后，细胞活率均高于90％。
[0046]
本发明实施例分别分化第8天、第15天以及第21天的心肌细胞以相同的冻存密度在相同冻存液中冻存12个月的细胞活率，结果显示实施例1中第1组冻存液冻存的心肌细胞随着分化时间延长，心肌细胞成熟度增加，冻存后的心肌细胞活率明显降低。而实施例1中第2至8组冻存液冻存的心肌细胞活率不会随着心肌细胞分化时间的延长而有明显改变。
[0047]
实施例4冻存对心肌细胞电生理活性的影响
[0048]
用膜片钳检测并记录有搏动的心肌细胞的电生理特性
[0049]
将具有相同成熟度的同一批次的心肌细胞分别在实施例1中提供的冻存液中冻存12个月后进行复苏并在心肌细胞培养基中进行培养，培养48h后选择有搏动的心肌细胞同样进行膜片钳实验，其中心肌细胞培养基为购买的心肌细胞培养基商品。
[0050]
图1为未经冻存的心肌细胞的动作电位，显示其动作电位时长apd为416.10
±
32.61，实施例1中第1组冻存液冻存的心肌细胞的动作电位时长apd为265
±
36.98，而实施例1中第2至8组心肌细胞冻存液冻存的心肌细胞的动作电位时长均在400ms左右，由此可见，本发明实施例1中第2到8组提供的心肌细胞冻存液对于冻存的心肌细胞的电生理活性具有较好的维持作用。